Реакция преципитации. Её модификации. Реакция преципитации, ее разновидности, механизм и применение Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони

Заключающаяся во взаимодействии растворимого антигена с антителом с последующим выпадением мелкозернистого осадка (преципитата).

Реакция преципитации позволяет определить в исследуемом материале присутствие неизвестного антигена путем добавления известного антитела или при помощи известного антигена - неизвестное антитело. Преципитация идет хуже в отсутствие солей. Оптимум преципитации находится в диапазоне рН=7,0-7,4.

Механизм преципитации близок к механизму агглютинации. Под влиянием иммунной , прореагировавшей с антигеном, уменьшается степень его дисперсности. Необходимо, чтобы сыворотка и антиген были совершенно прозрачны. При постановке преципитации можно к одному разведению сыворотки добавлять разные разведения антигена либо наоборот.

Преципитация регистрируется лучше, если антиген наслаивать в пробирке на антитело. При этом наблюдается появление преципитата в виде кольца - кольцепреципитация. Кольцепреципитацию проводят в специальных пробирках диаметром 2,5-3,5 мм. Для определения числа антигенов в исследуемом материале или разных антител в сыворотке пользуются реакцией преципитации в агаре: 1% осветленный агар разливают в или на предметные стекла. В разные лунки, сделанные в агаре, наливают растворы антигена и антитела, которые диффундируют навстречу друг другу, образуя линии преципитации. Реакция преципитации широко используется при диагностике (см. Асколи реакция).

Преципитация в агаре позволяет определять токсигенность дифтерийных культур.

В судебно-медицинских исследованиях преципитация служит для установления видовой принадлежности крови, органов и тканей с помощью специфических преципитирующих сывороток.

Преципитация - реакция осаждения комплекса антигена (преципитиногена) и антитела (преципитина). Преципитация - один из иммунологических феноменов, позволяющих определить содержание антител (см.) в сыворотке крови больных или вакцинированных людей, а также в крови иммунизированных животных. При использовании стандартных сывороток реакция преципитации может быть применена для титрования различных по происхождению растворимых антигенов (см.).

При наиболее простой форме постановки реакции преципитации к ряду пробирок с постоянным количеством антигена добавляют подслаиванием исследуемую сыворотку в серии кратных разведений. После 30-60 мин. инкубации при комнатной температуре на границе двух жидкостей образуется кольцо помутнения - кольцепреципитация. Минимальное количество сыворотки, которое дает реакцию преципитации, принимают за титр антисыворотки. При обратной постановке реакции со стандартной антисывороткой удается оценить относительную концентрацию антигена в различных биологических жидкостях.

Результаты титрования антител и антигенов на основании вышеуказанного метода не имеют абсолютного количественного выражения. С целью количественной оценки содержания антител Гейдельбергер, Кабат (М. Heidelberger, Е. Kabat) и др. разработали количественный метод реакции преципитации, в основе которого лежит обнаружение так называемые зоны эквивалентности. При смешивании возрастных количеств антигена с постоянными объемами антисыворотки количество образующегося преципитата первоначально возрастает, а затем вновь снижается из-за увеличения растворимости комплекса антиген - антитело в избытке антигена. Если определить во всех пробирках содержание антител в надосадочной жидкости, то окажется, что в средних пробирках ряда или даже в единственной пробирке антител в надосадочной жидкости нет; вместе с тем здесь же образуется наибольший по величине преципитат. Поскольку в зоне эквивалентности в преципитат вовлекается также весь антиген, введенный в смесь реагирующих веществ, после вычитания из количества белка преципитата белка антигена получают точную величину содержания антител в данном объеме испытуемой сыворотки. Содержание белка преципитата после тщательного промывания охлажденным физиологическим раствором определяют по азоту или каким-либо колориметрическим методом.

При оценке значения реакции преципитации как диагностического метода необходимо учитывать, что в иммунных сыворотках могут присутствовать антитела, не обладающие свойствами преципитинов и, следовательно, не образующие преципитата при взаимодействии с антигеном. К их числу относятся прежде всего неполные антитела, а также некоторые другие антитела, относящиеся к группе гамма-А-глобулинов.

Способность антисыворотки преципитировать антиген может быть нарушена нагреванием до 65-70°, обработкой органическими растворителями, восстановлением в кислой среде [Изликер (Н. Isliker), А.Я. Кульберг]. Феномен преципитации с антисывороткой, заведомо содержащей преципитины, возможен лишь при определенной температуре, концентрации солей и водородных ионов. Быстрее всего реакция преципитации протекает при 25-37°. Непременное условие образования преципитата - присутствие в изотонических концентрациях хлорида натрия (0,85% раствора NaCl). При увеличении концентрации NaCl до 15% преципитаты, образованные антигеном полисахаридной природы, частично растворяются, чем можно воспользоваться для извлечения чистых антител. Реакция преципитации с антигенами белковой природы протекает с одинаковой скоростью и полнотой как в 0,85%, так и в 15% растворах NaCl. Оптимальная для образования преципитата концентрация водородных ионов соответствует значениям рН от 5,0 до 9,0.

В лабораторной практике находят применение различные модификации реакции преципитации. В частности, реакцию термопреципитации применяют для обнаружения антигенов бактерий сибирской язвы, ботулизма и др., не подвергающихся термической денатурации (коктоантигены). Эта реакция отличается от реакции кольцепреципитации только тем, что в качестве антигена используют фильтрат прокипяченного исследуемого материала (см. А сколи реакция).

При анализе с помощью реакции преципитации сложной смеси антигенов невозможно охарактеризовать свойства отдельных компонентов смеси. Для решения этой задачи прибегают к методам преципитации в агаре и к иммуноэлектрофорезу. Метод преципитации в агаре в наиболее распространенной модификации Оухтерлоню (О. Ouchterlony) основал на том, что антиген и антисыворотка, диффундируя навстречу друг другу в тонком слое агара, образуют при встрече линии преципитации. По числу таких линий можно судить о количестве компонентов, содержащихся в данной смеси антигенов. Метод Оухгерлоню позволяет сравнивать различные антигенные смеси и определять степень родства присутствующих в них компонентов. При анализе сложной антигенной смеси, содержащей вещества с одинаковыми скоростями диффузии в агаре, большую помощь может принести метод иммуноэлектрофореза. Смесь антигенов предварительно разделяют в электрическом поле в пластинке агара, после чего проявляют отдельные компоненты антисывороткой. Антисыворотку вносят в ровик, проделанный в агаре параллельно линии, вдоль которой перемещались при электрофорезе антигены. Каждый из антигенов дает с антисывороткой индивидуальную дугу преципитации. Иммуноэлектрофорез широко применяют для анализа патологических отклонений в белках сывороток, а также при иммунологическом анализе тканевых и бактериальных антигенов.

Преципитация в судебно-медицинском отношении . Преципитация применяется в судебной медицине для установления видовой принадлежности крови, частей органов и тканей. В ряде следственных дел требуется установить видовую принадлежность крови, обнаруженной на орудиях совершения преступления, одежде преступника или жертвы и др. Для реакции преципитации применяют преципитирующие сыворотки, получаемые иммунизацией кроликов, петухов, коз белками разных животных. Обычно изготовляют сыворотки, преципитирующие белок человека, лошади, кошки, курицы, свиньи, собаки, рогатого скота. Они должны обладать титром не ниже 1:10 000 и быть достаточно специфичными. Из исследуемого пятна или корочки крови готовят вытяжки на физиологическом растворе, которые затем испытывают преципитирующими сыворотками. Вид белка считается установленным, если одна из преципитирующих сывороток образует преципитат с вытяжкой из исследуемой крови при соответствующей контрольной реакции. Реакцией преципитации можно установить также вид белка тканей и органов человека или животных. Обычно реакцию преципитации производят в пробирках с конусообразным концом. При получении мутных вытяжек реакцию преципитации производят в агаре по Оухтерлоню.

Реакция преципитации (РП)

Феномен преципитации заключается во взаимодействии мелкодисперсных антигенов (преципитиногенов) с соответствующими антителами (преципитинами) и образованием преципитата (рис. 1). Постановку РП осуществляют двумя методами: в жидкой среде - по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации или в плотной среде в агаре (геле). РП применяют в двух целях: выявление антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке или антител с использованием известных антигенов. Существует много вариантов постановок реакции, но чаще всего используют следующие методики: реакция преципитации в геле по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза, реакция флокуляции, кольцепреципитации.

Рис. 1. Реакция преципитации:1 - антиген; 2 - антитело.

Реакция преципитации в геле по Оухтерлони. Для постановки реакции используют 1% агар Дифко, который разливают расплавленным на предметные стекла или чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. В застывшем агаре вырезают лунки диаметром 5 мм специальным приспособлением. В одну лунку помещают взвесь, содержащую исследуемый антиген, в другую - иммунную сыворотку. Антиген и антитела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Учет реакции проводят предварительно через 4 часа, окончательно - через 24-48 часов. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бактерий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток (рис. 2).

Рис. 2. Реакция преципитации: А - реакция кольцепреципитации; Б - реакция преципитации по Оухтерлони.

Реакция кольцепреципитации

Данную реакцию применяют для выявления антигенов с помощью иммунной преципитирующей сыворотки, содержащей специфические антитела. Это качественный метод исследования. Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку среды, содержащей определенный антиген. Реакцию ставят в узких пробирках объемом 0,1- 0,5 мл. В случае соответствия антигена и антитела на границе между ними через 3-5 мин образуется кольцо преципитации (рис. 2). Необходимым условием образования нерастворимого иммунного комплекса является эквивалентное соотношение антигенов и антител.

Радиальная иммунодиффузия по Манчини

Радиальная иммунодиффузия по Манчини позволяет использовать моноспецифические антисыворотки и эталон с известным содержанием антигена. Тест-антиген и разведения растворов, исследуемых на наличие данного антигена, помещают в лунки, вырезанные рядами в пластине геля, куда предварительно внесена соответствующая моноспецифическая антисыворотка. Антиген диффундирует в гель и, соединившись со специфическими антителами, формирует кольца преципитации, диаметры которых зависят от концентрации антигена в лунках. Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметров преципитантов от концентрации антигена в исследуемых растворах (рис. 3). Принцип радиальной диффузии положен в основу метода, применяемого для изучения токсигенности бактериальных культур и отбора из бактериальной популяции клонов с высокой степенью токсичности. В этом случае исследуемые культуры засевают в чашки с агаром, содержащим антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных колоний образуются кольца преципитации, диаметр которых прямо пропорционален степени токсичности штамма (рис. 3).

Рис. 3. Простая радиальная иммунодиффузия:а - кольца преципитации;б - калибровочная кривая.

Реакция иммуноэлектрофореза (ИЭФ)

В основе реакции лежит принцип преципитации. ИЭФ, как правило, используется для исследования антигенной структуры микроорганизмов. Реакцию проводят в два этапа. Вначале проводят электрофоретическое разделение антигена в забуференном агаровом геле. Антигенный комплекс помещают в лунку, которая находится в центре геля, залитого на стеклянную пластинку. Затем через гель пропускают электрический ток, в результате происходит перемещение антигенов на неодинаковые расстояния соответственно своей электрофоретической подвижности. После этого в канавку, которая расположена по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. Антигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу. В месте их соприкосновения образуются дугообразные линии преципитации. С помощью ИЭФ анализируются состав и количество белков сыворотки крови, спиномозговой жидкости, микробных протеинов (рис. 4).

/ 34
ХудшийЛучший

В основе реакций преципитации лежит образование и выпадение в осадок комплексов антиген-антитело. В реакции участвуют растворимые антигены: преципитиногены (продукты микроорганизмов, тканей, химические вещества и лекарства). Антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами, вызывают их агрегацию, что проявляется в помутнении прозрачных жидкостей или выпадении осадка (преципитата). Диагностические преципитирующие сыворотки выпускают с высоким титром антител. Их получают путем иммунизации лабораторных животных соответствующим антигеном. Титром преципитирующей сыворотки является минимальное количество антигена, которое данная сыворотка может преципитировать.

Реакцию преципитации можно проводить в жидкой и плотной среде (в агаре или геле).

Реакция преципитации в жидкой среде (кольцепреципитация). Реакцию ставят в узких пробирках, куда вносят преципитирующую антисыворотку, а сверху осторожно наслаивают прозрачный раствор антигена. При положительной реакции через несколько минут на границе соприкосновения двух жидкостей появится кольцо преципитации. При малых количествах реагентов реакцию можно проводить в капиллярах (микропреципитация).

Реакция преципитации в агаре. Сущность реакции в том, что антигены и антитела, помещенные в разные лунки в агаре, диффундируют навстречу друг другу и при взаимодействии образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитации.

Двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони. Реакцию проводят на пластинках с агаровым гелем. Растворы антигена и антисыворотки помещают в лунки, вырезанные на некотором расстоянии друг от друга. Иммунореагенты диффундируют в геле, при встрече образуют комплексы, которые осаждаются в виде линий преципитации. Этот метод позволяет исследовать сразу несколько образцов иммунореагентов. Например, вокруг лунки с антисывороткой можно разместить несколько лунок с растворами разных антигенов или наоборот.

Метод определения токсигенности микробов в реакции преципитации. Принцип иммунодиффузии в геле положен в основу метода, который применяется для изучения токсигенности (способности вырабатывать токсин) бактерий. Например, для обнаружения дифтерийного токсина на чашку Петри с агаром посередине накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической сывороткой. Рядом засевают исследуемые культуры бактерий. Если они выделяют токсин, то при взаимодействии с антитоксинами между колониями и полоской бумаги образуются линии преципитации.

Иммунодиффузия в геле лежит в основе реакции преципитации по Манчини, которая используется для определения классов иммуноглобулинов в сыворотке крови (см. иммуноглобулины).

Реакции преципитации используются для; определения антигенов бактерий, тканей человека и животных; диагностики некоторых инфекционных заболеваний; определения видовой принадлежности белка в судебной медицине; выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изделиях в санитарной практике.

В виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.
Реакция кольцепреципитации. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген . При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата (рис. 7.50). Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).

Рис. 7.50.

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.

Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы (рис. 7.51). У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных антигенов линии преципитата сливаются, у неидентичных - пересекаются.

Рис. 7.51

Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген (Аг) в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена (рис. 7.52). Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

Рис. 7.52.

Сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку геля параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку. Антитела иммунной сыворотки диффундируют в гель и образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации (рис. 7.53).

Рис. 7.53.

Реакция флоккуляции (по Рамону) {от лат. floccus - хлопья шерсти} - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин (рис. 7.54). Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

Рис. 7.54.

Штаммы возбудителя дифтерии - С. diphtheriae могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина. При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность - продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре (рис. 7.55).

Рис. 7.55

Преципитации реакция преципитации реакция

реакция взаимодействия in vitro антигена с антителом, приводящая к видимому невооруженным глазом помутнению среды или образованию осадка иммунного комплекса (преципитата). Применяется для идентификации антигенов и антител, контроля чистоты антигена, количественного определения антигенов и антител в исследуемом материале. Дляпостановки П. р. необходимы прозрачные растворы антигена и соответствующей сыворотки.

(Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н., М: Дрофа, 2006 г.)

пробирочная реакция взаимодействия Ат с Аг в жидкой фазе или в геле, к-рая приводит к образованию видимых невооруженным глазом иммунных преципитатов (помутнения). Применяют для идентификации Аг и Ат, контроля чистоты Аг, количественного содержания Ат и Аг. Для постановки П. р. необходимы прозрачный р-р Аг, антисыворотка, физраствор или гель (1,5 - 2% агаровый и агарозный в вероналацетатном буфере, рН 6,8, ионная сила - 0,1). Чаще используют следующие методики: 1) реакцию колъцепреципитации. В преципитационную пробирку (пробирки) наливают по 0,2 мл преципитирующей с-ки с высоким титром и на нее осторожно наслаивают примерно такое же количество р-ра Аг (цельного или разведенного). В положительном случае через несколько минут на границе реагентов образуется подвижное кольцо белого цвета. Обязательны контроли Аг, с-ки, заведомо положительный, заведомо отрицательный и др. Применяют для идентификации Аг в экстрактах из различных материалов, в т.ч. инфекц.; 2) двойную радиальную иммунодиффузию по Оухтерлони. В равномерном слое 1% агарового геля толщиной около 1,5 мм пробивают лунки на расстоянии 4-10 мм и заполняют их р-рами антисыворотки и Аг. Результат учитывают через сутки (до 6 - 7 сут) инкубации при 4°, 20° и 37°С на влажном или высушенном и окрашенном препарате по числу и расположению линий преципитации. У однокомпонентных систем между лунками с Аг и Ат появляется одна линия, у многокомпонентных -несколько линий, при идентичных Аг линии сливаются, при неидентичных- пересекаются. Используют для качественного анализа, определения чистоты препаратов, идентификации Ат и Аг; 3) простую линейную иммунодиффузию по Удену. Применяют с теми же целями, что и двойную. Содержащий антисыворотку гель разливают по пробиркам или трубочкам. На гель в пробирках наливают р-р Аг, а трубочки помещают в стаканчик с р-ром Аг. Результаты учитывают после выдерживания системы при +4°С в течение 48 ч по наличию преципитата и фронта, к-рый прошел Аг. По формуле находят количество Аг; 4) простую радиальную иммунодиффузию по Манчини. Гель с моноспецифической с-кой ровным слоем наливают на стеклянную поверхность. После застывания в геле пробивают лунки и заливают в них р-ры иссл. Аг. Систему выдерживают 40 ч при +4° или 20°С. В положительных случаях вокруг лунки образуется преципитат, площадь к-рого отражает количество Аг. Аналогичным образом ставят контроль с серией разведении стандартного Аг. Измеряют диаметр зоны преципитата, высчитывают площадь и по калибровочной кривой находят количество Аг в 1 мл субстрата.

(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)

Смотреть что такое "преципитации реакция" в других словарях:

реакция преципитации - — [Англо русский глоссарий основных терминов по вакцинологии и иммунизации. Всемирная организация здравоохранения, 2009 г.] Тематики вакцинология, иммунизация EN precipitation reaction … Справочник технического переводчика

- (RW или ЭДС Экспресс Диагностика Сифилиса) устаревший метод диагностики сифилиса. В настоящее время заменён микрореакцией преципитации (антикардиолипиновый тест, MP, RPR Rapid Plasma Reagin). Названа по имени немецкого иммунолога Августа… … Википедия

реакция преципитации - rus реакция (ж) преципитации eng precipitin test, precipitation test fra réaction (f) de précipitation (f) deu Präzipitintest (m), Präzipitations Reaktion (f) spa reacción (f) de precipitación, reacción (f) de precipitinas, prueba (f) de… … Безопасность и гигиена труда. Перевод на английский, французский, немецкий, испанский языки

Метод обнаружения и идентификации антител или растворимых антигенов, основанный на феномене преципитации … Большой медицинский словарь

Преципитация (лат. praecipitatio стремительное падение) В химии и биохимии синоним слова осаждение В иммунологии иммунологическая реакция осаждения из раствора нерастворимого комплекса антиген антитело, образующегося в результате соединения… … Википедия

Метод обнаружения малых концентраций антител, моновалентных гаптенов или поливалентных антигенов, основанный на торможении в их присутствии реакций преципитации, агглютинации или связывания комплемента вследствие специфического блокирования… … Большой медицинский словарь

Модификация реакции преципитации, при которой регистрируют формирование преципитата в виде кольца на границе между растворами антигена и антител … Большой медицинский словарь

Тест на наличие сифилиса, в котором определение характерных для этого заболевания антител в крови обследуемого производится с помощью реакции преципитации. Данный тест является менее доступным, чем некоторые другие.