Страница 33 из 91

Реакция связывания комплемента (РСК)
Соединение антитела с антигеном и комплементом не обязательно сопровождается разрушением антигена. Это. в большей степени относится к микробам, которые проявляют устойчивость к литическому действию комплемента. Происходящее в таких случаях связывание комплемента может быть выявлено непрямым путем с помощью метода, открытого Ж. Борде и С. Жангу. Сущность метода заключается в следующем. При взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном происходит соединение антигена с антителом, образуется комплекс антитела с антигеном, который связывает комплемент. В случае несоответствия антигена и антитела связывания комплемента не происходит, т. е. комплемент остается свободным. Процесс связывания комплемента при положительной реакции антитела с антигеном остается невидимым. Поэтому для определения, связался ли комплемент или остался свободным, в качестве индикатора в реакцию вводится гемолитическая система (гемолитическая сыворотка - гемолизины и эритроциты барана). Реакция связывания комплемента ставится в две фазы: в первой фазе к исследуемой сыворотке (антителу) добавляется антиген и комплемент, во второй - добавляется гемолитическая система.
Если в первой фазе реакции исследуемая сыворотка содержит специфические для антигена антитела, то комплемент будет связан с комплексом антиген+антитело, при добавлении гемолитической системы гемолиз не произойдет и реакция будет считаться положительной.
Если же исследуемая сыворотка не содержит специфических антител, т. е. антиген и антитела не соответствуют друг другу, тогда комплемент в первой фазе реакции остается свободным и при добавлении гемолитической системы произойдет гемолиз (растворение) эритроцитов, т. е. реакция будет отрицательной (см. рис. 57).
Реакция Борде-Жангу (реакция связывания комплемента), обладающая высокой чувствительностью, приобрела большое диагностическое значение. Это значение еще больше увеличилось, когда Жангу показал, что реакция может происходить не только с бактериальными телами, но и с их экстрактами. Реакция Борде-Жангу применяется при диагностике сапа, гонореи и других заболеваний. А. Вассерман, исходя из идеи Ж. Борде, применил реакцию связывания комплемента для серодиагностики, сифилиса. Эта реакция получила практическое применение в распознавании сифилиса.
Реакция связывания комплемента применяется с двоякой целью:

1. Для обнаружения в сыворотке специфических антител с помощью известного антигена. Например, имея антиген, приготовленный из культуры гонококка, можно обнаружить гонококковые антитела в сыворотке больного. В этом случае необходимо пользоваться антигеном, доза которого, связывающая комплемент, заранее вытитрована на значительном количестве сывороток больных.
2. Для определения вида антигена при помощи сыворотки, содержащей антитела к определенному антигену. Например, при помощи соответствующей иммунной сыворотки можно идентифицировать палочку коклюша. В этих случаях необходимо иметь сильную иммунную сыворотку, титр которой известен.

Ингредиенты (составные части) реакции. Для реакции связывания комплеме-нта необходимы следующие ингредиенты: 1) эритроциты барана, 2) гемолитическая сыворотка, 3) комплемент, 4) антиген и 5) испытуемая сыворотка.
1. Эритроциты получают из дефибрин ированной крови барана. Для этого у барана берут кровь из яремной вены непосредственно в банку со стеклянными бусами. Встряхивают в течение 10 минут. Процеживают через стерильную марлю, центрифугируют и сыворотку отсасывают. Три раза отмывают эритроциты от остатка сыворотки физиологическим раствором хлористого натрия центрифугированием в течение 10-15 минут. После третьего центрифугирования из осадка приготовляют 3% взвесь эритроцитов для опыта. При хранении в леднике дефибринированная кровь может употребляться в течение 6-8 дней.

Схема приготовления разведений гемолитической сыворотки из основного разведения 1: 100

1. Гемолитическая сыворотка обычно получается от кроликов, иммунизированных эритроцитами барана. Гемолитическую сыворотку выпускают в сухом виде институты бактерийных препаратов. На этикетке ампулы указан титр сыворотки и срок годности.

Таблица 4
Схема титрования гемолитической сыворотки

Титром гемолитической сыворотки называется ее предельное разведение, способное в объеме 0,5 мл растворить 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов в присутствии 0,5 мл комплемента в течение часа при температуре 37°.
Титр гемолитической сыворотки определяется по следующей схеме: приготовляют основное разведение выворотки 1: 100 (0,1 мл сыворотки+0,9 мл физиологического раствора), из которого готовят дальнейшие разведения (табл. 3).
В ряд пробирок последовательно отмеривают по 0,5 мл полученных разведений гемолитической сыворотки, начиная с 1: 1000, добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл комплемента, разведенного 1:10, и по 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов. Титрование гемолитической сыворотки проводится по схеме (табл. 4).
Из схемы видно, что данная сыворотка еще в разведении 1: 1500 дает полный гемолиз (т. е. титр сыворотки 1: 1500). В дальнейшем для опыта берут в 3 раза меньшее разведение (тройной титр). Так, например, если титр гемолитической сыворотки 1: 1500, применяется разведение 1:500 (т. е. 0,1 мл сыворотки 49,9 мл физиологического раствора).

1. Комплемент. В качестве комплемента в реакции служит сыворотка морских свинок (их комплемент обладает наибольшей активностью) или сухой комплемент, выпускаемый институтами бактерийных препаратов.

Так как степень активности комплемента не у всех морских свинок одинакова, необходимо брать кровь у нескольких животных и полученные сыворотки смешивать.
Титром комплемента обозначается первая минимальная доза комплемента, растворяющая эритроциты. Если, например, в приведенной схеме титрования полный гемолиз произошел в пробирке, содержащей 0,3 мл комплемента, и неполный гемолиз оказался в пробирке, содержащей 0,25 мл комплемента, то титром комплемента надо считать 0,3 мл в разведении 1: 10. В качестве рабочей дозы комплемента обычно берется титр его, увеличенный на 20-25%, т. е. приблизительно это соответствует тому количеству комплемента, которое содержится в предпоследней пробирке с гемолизом.
Как при титровании гемолитической сыворотки, так и при титровании комплемента ставятся два контроля (см. табл. 5).

Схема титрования комплемента без антигена


Таблица 6
Схема титрования комплемента в присутствии антигена

Кроме того, рекомендуется титровать комплемент также в присутствии антигена.
Титрование комплемента в присутствии антигена необходимо в тех случаях, когда антиген подавляет титр комплемента (антикомплементарное свойство антигена). Это свойство может зависеть как от природы самого антигена, так и от способа его приготовления.

1. Антиген. В реакции связывания комплемента используются различные антигены. Антигенами являются культуры разнообразных микробов или экстракты патологически измененных или нормальных тканей. В качестве бактериального антигена могут употребляться как взвеси микробов в физиологическом растворе, так и экстракты из микробов, приготовленные различными способами (например, антиформиновый гонококковый антиген, спиртовой туберкулезный и т. п.). Хорошими антигенными свойствами обладает микробная взвесь, предварительно убитая парами формалина или обработанная алкоголем. Для реакции исходную взвесь антигена разводят по оптическому стандарту, содержащему. 1 млрд. микробных тел в 1 мл, и берут в объеме 0,5 мл.

В качестве антигена применяют также микробные лизаты в дистиллированной воде или физиологическом растворе, полученные в шюттель-аппарате (аппарат для встряхивания) или путем обработки антиформином.
Для реакции следует употреблять такую дозу антигена, которая вызывает полную задержку гемолиза с сыворотками, содержащими соответствующие гемолизины, но которая сама по себе задержки гемолиза не дает. В силу того, что все микробные антигены адсорбируют какое-то количество комплемента, перед титрованием их проверяют на антикомплементарные свойства, определяя растворяющую дозу комплемента, т. е. то наибольшее количество антигена, которое не вызывает задержки гемолиза. Определение такой растворяющей дозы антигена производится по схеме (табл. 7).
Из таблицы видно, что в данном примере растворяющая доза антигена составляет 0,4 мл. Для опыта берут половину такой дозы, т. е. ориентировочная доза будет равна 0,2 мл.

1. Испытуемая сыворотка. Сыворотку больного отделяют от сгустка через 3-48 часов после взятия крови и инактивируют в водяной бане при 56° в течение 30 минут.

Таблица 7 Схема определения растворяющей дозы антигена

Инактивированные сыворотки могут сохраняться в холодильнике в течение 5-6 дней. Для реакции сыворотка больного применяется в разведении 1:5 (0,1 мл сыворотки+0,4 мл физиологического раствора).
Постановка опыта реакции связывания комплемента (табл. 8).
Для постановки реакции связывания комплемента необходимы следующие ингредиенты:

1. физиологический раствор (0,85%);
2. сыворотка, подлежащая исследованию, инактивированная при 56° в течение 30 минут в водяной бане;
3. антиген (взвесь бактерий или экстракт из них), не вызывающий самостоятельно ни гемолиза, ни задержки его в дозе, установленной титрованием;
4. комплемент в рабочей дозе, установленной титрованием;
5. гемолитическая сыворотка в дозе, соответствующей ее утроенному титру;
6. 3% взвесь бараньих эритроцитов.

Каждый из ингредиентов, который применяется для реакции, берется в количестве 0,5 мл. Если доза отдельного компонента меньше этого объема, то ее дополняют физиологическим раствором до 0,5 мл.
Основной опыт связывания комплемента желательно ставить сразу с двумя - тремя антигенами, приготовленными различным способом (А1, А2, А3 в табл. 8).

Схема основного опыта

Для контроля необходимо одновременно ставить реакцию точно в тех же условиях с нормальной сывороткой и сывороткой, заведомо дающей положительный результат. При постановке реакции сначала смешивают исследуемую сыворотку, антиген и комплемент. Смесь выдерживают при 37° в течение часа. По истечении указанного срока в пробирку добавляют смесь гемолитической сыворотки и эритроцитов - гемолитическую систему. Гемолитическую систему добавляют или непосредственно после приготовления смеси из равных объемов гемолитической сыворотки и эритроцитов, или после получасового выдерживания этой смеси в термостате. Смесь всех ингредиентов после энергичного встряхивания помещают в термостат при 37° на 1 час, а затем на 12 часов переносят в холодильник или оставляют при комнатной температуре.
В пробирках, в которых произошел гемолиз, жидкость становится прозрачной, но окрашенной (см. рис. 58).

Рис. 58. Схема реакции связывания комплемента.
а - реакция положительная; б - реакция отрицательная.

Результат реакции обозначается или словами «положительная», «отрицательная» реакция, или знаком плюс (+) или минус (-). Но так как степень задержки гемолиза может колебаться в пределах от полной задержки до очень слабой, обозначения могут быть следующие:
(++ + +)-полная задержка гемолиза; жидкость не окрашена, значительный осадок эритроцитов;
(+ + +) -ясная задержка гемолиза; жидкость окрашена, осадок эритроцитов;
(++)-частичная задержка гемолиза; жидкость окрашена интенсивно; компактный осадок эритроцитов;
(+)-очень слабая задержка гемолиза; жидкость окрашена интенсивно, осадок небольшой;
(±) -следы задержки гемолиза, при взбалтывании заметен незначительный осадок;
(-)-полный гемолиз (отрицательная реакция).

Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента (РДСК)

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК) И РЕАКЦИЯ ДЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РДСК)

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА, РСК, реакция Борде - Жангу [по имени бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологич. реакция, основанная на свойстве комплекса антиген - антитело фиксировать свободный комплемент.

Комплемент (система комплемента) (от лат.complementum - дополнение), группа глобулярных белков сыворотки крови животных и человека, представляющих собой часть иммунной системы организма. При попадании в организм инфицирующих его бактерий или вирусов, некоторых токсинов или возникновении собственных трансформированных клеток происходит активация комплемента, в результате чего клетки-мишени лизируются (разрушаются), а токсины и вирусы нейтрализуются. Поэтому систему комплементов рассматривают наряду с макрофагами как передовой рубеж иммунной защиты организма.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело. По существу, это две серологические реакции.

Первая система - основная состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

связывание комплемент реакция серодиагностика

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет - так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее Осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и комплемент останется свободным. Оставшийся свободным, комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, - результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - "лаковая кровь").

Компоненты реакции связывания комплемента:

1. Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен; реже взвесь микроорганизмов

2. Антитело - сыворотка больного

3. Комплемент - сыворотка морских свинок

4. Антиген - эритроциты барана Гемолитическая система

5. Антитело - гемолизин к эритроцитам барана

6. Изотонический раствор

Подготовка ингредиентов

1. Сыворотку разводят в 3 раза меньше ее титра. Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта, объем которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте. Избыток жидкости необходим при приготовлении всех компонентов реакции: часть ее остается на стенках пробирок, колб, пипеток. Объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°С (сенсибилизируют).

2. Эритроциты барана. Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана на все количество пробирок в опыте. Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные объемы эритроцитов барана с антителом к ним.

3. Комплемент обычно разводят 1: 10. Перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента - это его наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37°С.

4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т.е. того количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл. Например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт берут количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Готовят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.

5. Антитело - сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56°С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева

Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента).

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1: 5 и 1: 10 (доза сыворотки 0,04 куб. см и 0,02 куб. см со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном (на специфичность) и без антигена (на антикомплементарность).

Испытуемые и контрольные сыворотки инактивируют в день постановки реакции в разведенном виде при 56-65°С (в зависимости от вида животных) в течение 30 мин. (также в РДСК).

Оба этапа реакции проводят в водяной бане при 37-38°С, бактериолитическую систему выдерживают 60 мин, второй этап реакции (с гемолитической системой) - 20 мин.

Контроли главного опыта РСК:

позитивная сыворотка в разведении 1: 5 без антигена и с контрольным антигеном; в разведениях от 1: 5 до ее титра со специфическим антигеном;

негативная сыворотка в разведениях 1: 5 и 1: 10 со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном и без антигена - антигены специфический и контрольный в двойной дозе - на антикомплементарность (комплемент +) и на гемотоксичность (комплемент);

гемолитическая система на гемотоксичность (комплемент).

Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в другом - гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).

В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это - рабочая доза.

Существуют различные варианты постановки РСК: классич. метод постановки в виде макро - и микровариантов, реакция длительного связывания комплемента (РДСК) на холоде, метод количеств. РСК по 50 % -ному гемолизу сенсибилизированных эритроцитов и др. Для диагностики ряда заболеваний применяют более чувствительный метод - РДСК.

Постановка реакции длительного связывания комплемента (РДСК).

Первую фазу реакции проводят в холодильнике при 2-6°С в течение 16-18 час., вторую фазу в водяной бане 20 мин при 37-38°С.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1: 25 или 1: 30 (при определении его рабочего разведения).

В первый день разливают сыворотки и антиген для главного опыта. Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента). Контроли РДСК такие же как при постановке РСК.

Затем во все пробирки главного опыта и соответствующих контролей разливают комплемент по 0,2 куб. см в зависимости от его рабочего разведения, пробирки встряхивают и помещают в холодильник на 16-18 час. при 2-6°С.

На следующий день штативы с первой фазой вынимают из холодильника и после выдерживания в течение 20-30 мин. при комнатной температуре во все пробирки разливают гемолитическую систему в дозе (в приведенном примере - 0,6 куб. см). Штативы встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин. при 37-38°С.

Схема главного опыта РДСК представлена в таблице 3.

Учет результатов РСК, РДСК проводят дважды: первый раз - сразу после водяной бани, второй - после оседания эритроцитов на дно пробирки (через 3-4 часа после водяной бани) или на следующий день при хранении в холодильнике от 2° до 6°С.

Для объективного определения результатов реакции оценку рекомендуется проводить в процентах гемолиза. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным (100%) гемолизом и жидкость из них сливают в одну пробирку. Из нее готовят разведения с меньшим процентом гемолиза так называемую "Стандартную " шкалу.

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в "стандартных" пробирках и процент гемолиза выражают в крестах.

Степень задержки обратно пропорциональна проценту гемолиза эритроцитов:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная, бесцветная;

+++ (3 креста) - гемолиз 25 % эритроцитов;

++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;

(минус) - полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Оценка результатов РСК, РДСК.

Оценивают испытуемые сыворотки в разведениях 1: 5 и 1: 10 (0,04 куб. см, 0,02 куб. см) при полном гемолизе эритроцитов в контроле сыворотки без антигена и с контрольным антигеном.

Положительной оценивают реакцию при задержке гемолиза эритроцитов на 3-4 креста в разведении 1: 10.

Сомнительной - при задержке гемолиза эритроцитов на 1 крест в разведении сыворотки 1: 10 и от 2 до 4 крестов в разведении 1: 5.

Отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов в разведениях сыворотки 1: 5и 1: 10.

61. Реакции с участием комплемента. Реакция связывания комплемента. Механизм, компоненты, способы постановки, применение. Реакция радиального гемолиза

Реакции с участием комплемента

Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента комплексом анти­ген-антитело (реакция связывания компле­мента, радиального гемолиза и др.).

Реакция связывания комплемента (РСК ) за­ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc -фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комп­лексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным (рис. 13.8). РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (инди­каторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­тической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содер­жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антите­ло происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и ан­титело не соответствуют друг другу (в иссле­дуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - ан- тиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­лиз; реакция отрицательная.

РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи­лиса (реакция Вассермана).

Эту реакцию применяют для обнаружения антител в сыворотке крови больных при бактериальных, вирусных, протозойных инфекциях, а также для определения и типирования вирусов, выделенных у больных. РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых, кроме антигена, антитела и комплемента, участвует еще и гемолитическая система, выявляющая результаты реакции. РСК протекает в две фазы: первая - взаимодействие антигена с антителом при участии комплемента и вторая - выявление степени связывания комплемента при помощи гемолитической системы. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, полученной путем иммунизации лабораторных животных, эритроцитами. Эритроциты обрабатывают - сенсибилизируют, присоединяя к ним сыворотку при температуре 37°С, в течение 30 мин. Лизис сенсибилизированных эритроцитов барана наступает только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. В отсутствие его эритроциты не изменяются. Результаты РСК зависят от наличия в исследуемой сыворотке антител. Если сыворотка содержит антитела, гомологичные антигену, используемому в реакции, то образующийся комплекс антиген - антитело присоединяет, связывает комплемент. При добавлении гемолитической системы в этом случае гемолиза не произойдет, так как весь комплемент расходуется на специфическую связь комплекса антиген - антитело. Эритроциты остаются не измененными, поэтому отсутствие гемолиза в пробирке регистрируют как положительную РСК. При отсутствии в сыворотке антител, соответствующих антигену, специфический комплекс антиген - антитело не образуется и комплемент остается свободным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и вызывает гемодиз эритроцитов. Разрушение эритроцитов, их гемолиз характеризует отрицательную реакцию.

Для постановки РСК необходимы: сыворотка больного, комплемент, гемолитическая система, состоящая из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, а также изотонический раствор хлорида натрия. Реакцию ставят в серологических пробирках. Эритроциты барана получают из дефибринированной крови барана путем троекратного отмывания их изотоническим раствором хлорида натрия. Гемолитическую сыворотку выпускают в готовом виде в ампулах, на этикетке которых указан ее титр, т. е. максимальное разведение сыворотки, которое еще вызывает гемолиз при добавлении к эритроцитам в присутствии комплемента. Гемолитическую сыворотку получают путем иммунизации животных, например кролика эритроцитами барана. При постановке реакции сыворотку используют в тройном титре. Например, титр гемолитической сыворотки 1: 1200, а рабочее разведение 1: 400. В качестве комплемента используют свежую сыворотку крови морской свинки (в течение 24-48 ч) или сухой комплемент в ампулах. Предварительно перед постановкой РСК комплемент разводят 1: 10 и титруют для установления титра - наименьшего количества комплемента, которое дает гемолиз эритроцитов при соединении с гемолитической системой, используемой в данной реакции. Учитывая возможные антикомплементарные свойства антигена, при постановке реакции к установленному рабочему титру комплемента делают 20-30% надбавку.
Антигеном для РСК являются взвеси убитых бактерий, экстракты, приготовленные из этих взвесей, отдельные химические фракции микробов. Основное требование к антигену - отсутствие угнетения активности комплемента. Он не должен обладать антикомплементарными свойствами. Для выявления этих свойств антигена комплемент дополнительно титруют в присутствии используемого в реакции антигена. Существуют определенные схемы постановки РСК. Результаты реакции учитывают по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов в гемолитической системе. РСК применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде-Жангу), токсоплазмоза, риккетсиозных и вирусных заболеваний.

Реакцию радиального гемолиза (РРГ ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эрит­роциты барана и комплемент. После внесе­ния в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии анти­тел) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, крас­нухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после че­го к этому комплексу присоединяются ком­поненты комплемента, вызывая гемолиз.

Реакция связывания комплемента (РСК) – это метод серологического анализа, который по своей чувствительности сравним с методами преципитации, агглютинации и нейтрализации. РСК представляет собой метод, где используются две системы антиген-антитело:

первая – специфическая;

вторая – индикаторная (гемолитическая).

Для проведения РСК необходимы 5 компонентов: диагностируемый антиген, диагностические антитела, антиген-индикатор (эритроциты барана), индикаторные антитела (кроличьи гемолизины), комплемент.

Специфическое взаимодействие антигена и антитела сопровождается связыванием комплемента. Образовавшийся комплекс визуально не проявляется. В качестве индикатора используется гемолитическая система. Гемолитическая сыворотка сенсибилизирует эритроциты к действию комплемента, в присутствии которого происходит лизис эритроцитов (гемолез). Если гемолиза нет, значит комплемент связан первой системой, и, следовательно, антиген в ней соответствует антителу – положительный ответ. Если антитело не соответствует антигену, комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой, вызывая гемолиз – реакция отрицательная.

Для постановки РСК все ингредиенты реакции подготавливают и титруют до проведения основного опыта.

Сыворотку (больного или диагностическую) накануне проведения реакции прогревают на водяной бане при температуре 56ºС в течение 30 мин для инактивации ее собственного комплемента. Некоторые сыворотки, особенно иммунизированных животных, обладают антикомплементарными свойствами, т.е. способностью связывать комплемент в отсутствии гомологичного антигена. Антикомплементарность устраняют путем обработки их углекислым газом, прогреванием при температуре 57-58ºС, однократным замораживанием при температуре -20ºС или -70ºС и удалением осодка центрифугированием, добавлением к сыворотке комплемента в объеме 1:10 сыворотки и прогреванием ее после инкубации на холоде в течение 18-20 ч. Для предотвращения антикомплементарности сывороток их хранят в лиофилизированном виде или замороженном состоянии при низких температурах.

Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганиз мов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вируссодержащие материалы. Многие антигены из микроорганизмов получают производственным путем. Антикомплементарность антигенов устраняют при помощи таких методов, как термолиз (многократное замораживание и оттаивание), обработка жирорастворителями (эфиром, хлороформом, ацетоном), спиртами (метанолом, этанолом) и т.д.

В качестве комплемента используют сыворотку морской свинки, взятую непосредственно перед опытом; можно также применять сухой комплемент. Чтобы получить основной роаствор для последующего титрования, комплемент разводят 1:10 изотоноческим раствором натрия хлорида.

Эритроциты барана используют в виде 3 взвеси на изотоническом растворе натрия хлорида. Кровь (100-150 мл) берут из яремной вены, помещают в стерильную банку со стеклянными бусами, дефибринируют путем встряхивания в течение 10-15 мин и фильтруют через 3-4 слоя стерильной марли для удаления фибрина. Эритроциты отмывают 3 раза изотоническим раствором натрия хлорида, доливая его к осадку эритроцитов до первоначального объема крови. Эритроциты можно хранить 5-6 дней при температуре 4-6ºС. Срок хранения эритроцитов увеличивается при их консервировании с формалином.

Гемолитическую сыворотку для РСК получают следующим образом Иммунизируют кроликов путем введения им в вену уха 50% взвеси отмытых эритроцитов барана (по 1 мл 4-6 раз через день). Через 7 дней после последней инъекции получают пробную сыворотку. Если титр сыворотки не ниже 1:1200, то делают кровопускание. Сыворотку прогревают 30 мин при температуре 56ºС. Для предупреждения бактериального пророста в гемолитическую сыворотку добавляют консервант (мертиолят 1:10000 или 1 борную кислоту).

Гемолитическая система состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки (взятой в тройном титре) и 3 взвеси эритроцитов барана. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37ºС в течение 30 мин.

Титрование гемолитической сыворотки. Сыворотку титруют путем соединения 0,5 мл ее (в разведениях 1:600, 1:1200, 1:1600, 1:3200 и т.д.) с 0,5 мл 3 взвеси эритроцитов и 0,5 мл свежего комплемента в разведении 1:10. Объем смеси для реакции в контрольных пробирках доводят до 1,5 мл, добавляя изотонический раствор натрия хлорида. Результаты реакции учитывают через 1 ч инкубации при температуре 37ºС. Титром гемолитической сыворотки считают ее наибольшее разведение, вызывающее полный гемолиз. Хранят сыворотку в лиофилизированном виде.

Схема титрования гемолитической сыворотки

Титрование комплемента. Перед проведением опыта основной раствор комплемента (1:10) разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл и добавляют в каждую изотонический раствор натрия хлорида, доводя объем жидкости до 1,5 мл. Пробирки помещают в термостат при температуре 37ºС на 45 мин, затем добавляют в них гемолитическую систему и выдерживают в термостате в течение 30 мин, после чего определяют титр комплемента.

Для опыта берут рабочую дозу комплемента (содержащуюся в объеме 0,5 мл), которая выше титра на 20-30%.

Схема титрования комплемента

Термостат при температуре 37ºС в течение 45 мин

Термостат при температуре 37ºС в течение 30 мин

Титрование антигена. Антигены, используемые для РСК могут адсорбировать какое-то количество комплемента, т.е. обладать антикомплементарными свойствами. Поэтому перед проведением опыта антигены титруют в присутствии рабочей дозы комплемента. В меньшей степени антикомплементарные свойства выражены у специфических антигенов, выпускаемых производственным путем. Их титр определяют не перед каждым опытом, а один раз в месяц, учитывая возможность его уменьшения в процессе хранения.

Для определения титра антигена его разливают в ряд пробирок в уменьшающемся количестве от 0,5 до 0,05 мл, доводя объем в них до 1 мл путем добавления раствора натрия хлорида. Затем в каждую пробирку добавляют 0,5 мл рабочей дозы комплемента и помещают их в термостат на 1 ч при температуре 37ºС. После этого во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, снова выдерживают их в течение 1 ч в термостате и учитывают результаты реакции.

Титром антигена считают наименьшее его количество, при котором наступает полный гемолиз. Для РСК используют рабочую дозу антигена, составляющую примерно 1/2-1/3 титра. Антигены, в присутствии которых титр комплемента уменьшается более чем на 30%, непригодны для реакции.

Схема титрования антигена

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Проведение основного опыта РСК. Общий объем ингредиентов реакции – 2,5 мл, объем рабочей дозы каждого из них – 0,5 мл. В первую пробирку вносят сыворотку в соответствующем разведении, антиген и комплемент, во вторую – сыворотку в соответствующем разведении, комплемент и изотонический раствор натрия хлорида (контроль сыворотки), в третью – антиген, комплемент и изотонический раствор натрия хлорида (контроль антигена). Одновременно готовят гемолитическую систему, смешивая по 2 мл гемолитической сыворотки в тройном титре (по отношению к указанному в инструкции) и 3% взвеси эритроцитов барана (по отношению к исходному объему крови). Пробирки выдерживают в термостате при температуре 37ºС в течение 1 ч, затем в первые 3 пробирки (первая система) добавляют по 1 мл гемолитической системы (вторая система). После тщательного смешивания ингредиентов пробирки вновь помещают в термостат на 1 ч при температуре 37ºС.

Схема проведения основного опыта РСК

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Результаты реакции учитывают предварительно – после извлечения пробирок из термостата и окончательно – после пребывания их в течение 15-18 ч в холодильнике или при комнатной температуре.

При окончательном учете интенсивность реакции выражают плюсами: (++++) – резко положительная реакция, характеризующаяся полной задержкой гемолиза (жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты оседают на дно); (+++, ++) – положительная реакция, проявляющаяся усилением окраски жидкости вследствие гемолиза и уменьшением количества эритроцитов в осадке; (+) – слабо положительная реакция (жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов). При отрицательной реакции (–) наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно розовую окраску (лаковая кровь).

Предложен ряд модификаций РСК, отличающихся повышенной чувствительностью и меньшим объемом используемых ингредиентов. Так, например, при вирусологических исследованиях объем ингредиентов для РСК на холоде – 1 мл. Для капельной РСК берут 1 каплю сыворотки + 1 каплю антигена + 1 каплю комплемента + 2 капли гемолитической системы.

Реакция связывания комплимента нашла самое широкое распространение в микробиологической и серологической диагностике.

С помощью РСК обнаруживают комплементсвязывающие антитела в сыворотке крови больных сифилисом, сапом, хронической гонореей, риккетсиозами, вирусными заболеваниями и др.

Особый интерес РСК представляет для клинической иммунологии. Реакцию применяют для выделения различных субпопуляций лимфоцитов, для выявления антигенов HLA на тромбоцитах, перевиваемых лимфобластах, фибробластах, опухолевых клетках и тромбоцитоспецифических антигенов, а также соответствующих антител.

Лабораторная диагностика практически всех инфекционных заболеваний основана на выявлении в крови больного антител, которые вырабатываются на антигены возбудителя, методами серологических реакций. Они вошли во врачебную практику с конца девятнадцатого - начала двадцатого века.

Развитие науки помогло определить антигенную структуру микробов и химические формулы их токсинов. Это позволило создать не только лечебные, но и диагностические сыворотки. Их получают путем введения ослабленных возбудителей лабораторным животным. После нескольких дней выдержки из крови кроликов или мышей готовят препараты, используемые для идентификации микробов или их токсинов, используя серологические реакции.

Внешнее проявление такой реакции зависит от условий ее постановки и от состояния антигенов в крови больного. Если частички микробов нерастворимы, то они осаждаются, лизируются, связываются или иммобилизуются в сыворотке. Если антигены растворимы, то проявляется феномен нейтрализации или преципитации.

Реакция агглютинации (РА)

Серологическая реакция агглютинация является высокоспецифичной. Она проста в исполнении и достаточно наглядна, чтобы быстро определить наличие антигенов в сыворотке крови больного. Ее используют для постановки реакции Видаля (диагностика брюшного тифа и паратифа) и Вейгля (сыпной тиф).

Она основана на специфическом взаимодействии между антителами человека (или агглютининами) и микробными клетками (агглютеногенами). После их взаимодействия образуются частицы, которые выпадают в осадок. Это и есть положительный признак. Для постановки реакции могут использоваться живые или убитые микробные агенты, грибы, простейшие, и соматические клетки.

Химически реакция разбита на два этапа:

1. Специфическое соединение антител (АТ) с антигенами (АГ).
2. Неспецифическая - осаждение конгломератов АГ-АТ, то есть образование агглютината.

Реакция непрямой агглютинации (РПГА)

Для ее постановки используют очищенные бараньи эритроциты и красные кровяные тельца человека, предварительно обработанные антителами или антигенами (это зависит от того, что именно лаборант хочет найти). В некоторых случаях человеческие эритроциты обрабатывают иммуноглобулинами. Серологические реакции эритроцитов считаются состоявшимися, если произошло их осаждение на дно пробирки. О положительной реакции можно говорить, когда клетки располагаются в виде перевернутого зонтика, занимая все дно. Отрицательная реакция засчитывается, если эритроциты осели столбиком или в виде пуговки в центре дна.

Реакция преципитации (РП)

Серологические реакции этого типа служат для выявления крайне малых частиц антигенов. Это могут быть, например, белки (или их части), соединения белков с липидами или углеводами, части бактерий, их токсины.

Сыворотки для проведения реакции получают путем искусственного заражения животных, обычно кроликов. Таким методом можно получит абсолютно любую преципитирующую сыворотку. Постановка серологических реакций преципитации похожа по механизму действия на реакции агглютинации. Антитела, содержащиеся в сыворотке, соединяются с антигенами в образуя крупные белковые молекулы, которые осаждаются на дно пробирки или на субстрат (гель). Этот способ считается высокоспецифичным и может обнаружить даже ничтожно малые количества вещества.

Используется для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы, менингита и других заболеваний. Кроме того, задействован в судебно-медицинской экспертизе.

в геле

Серологические реакции можно проводить не только в жидкой среде, но и в агаровом геле. Это называется метод диффузной преципитации. С его помощью изучают состав сложных антигенных смесей. Этот способ основан на хемотаксисе антигенов к антителам и наоборот. В геле они движутся навстречу друг другу с разной скоростью и, встречаясь, образуют линии преципитации. Каждая линия - один комплект АГ-АТ.

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)

Антитоксические сыворотки способны нейтрализовать действие экзотоксина, который вырабатывают микроорганизмы. На этом и основаны данные серологические реакции. Микробиология использует этот способ для титрования сывороток, токсинов и анатоксинов, а также определения их лечебной активности. Сила нейтрализации токсина определяется условными единицами - АЕ.

Кроме того, благодаря этой реакции можно определить видовую или типовую принадлежность экзотоксина. Это применяется при дифтерии, ботулизма. Исследование можно проводить как «на стекле», так и в геле.

Реакция лизиса (РЛ)

Иммунная сыворотка, которая попадает в организм больного, обладает, кроме своей основной функции пассивного иммунитета, еще и лизирующими свойствами. Она способна растворять микробные агенты, клеточные чужеродные элементы и вирусы, поступающие в организм больного. В зависимости от специфичности входящих в состав сыворотки антител выделяют бактериолизины, цитолизины, спирохетолизины, гемолизины и другие.

Эти специфические антитела называются "комплемент". Он содержится практически во всех жидкостях тела человека, имеет сложную белковую структуру и крайне чувствителен к повышению температуры, встряхиванию, действию кислот и прямых солнечных лучей. Но в высушенном состоянии способен сохранять свои лизирующие свойства до полугода.

Существуют такие виды серологических реакций этого типа:

Бактериолиз;

Гемолиз.

Бактериолиз проводят, используя сыворотку крови пациента и специфическую иммунную сыворотку с живыми микробами. Если в крови присутствует достаточное количество комплемента, то исследователь увидит лизис бактерий, и реакция будет считаться положительной.

Вторая серологическая реакция крови заключается в том, что взвесь эритроцитов больного обрабатывают сывороткой, содержащей гемолизины, которые активизируются только в присутствии определенного комплимента. Если таковой имеется, то лаборант наблюдает растворение красных клеток крови. Данная реакция широко используется в современной медицине для определения титра комплемента (то есть его наименьшего количества, провоцирующего лизис эритроцитов) в сыворотке крови и для постановки анализа на связывание комплемента. Именно этим способом проводится серологическая реакция на сифилис -

Реакция связывания комплемента (РСК)

Эта реакция используется для того, чтобы обнаружить в сыворотке крови больного антитела к инфекционному агенту, а также с целью идентифицировать возбудителя по его антигенной структуре.

До этого момента мы описывали простые серологические реакции. РСК считается сложной реакцией, так как в ней взаимодействуют не два, а три элемента: антитело, антиген и комплемент. Суть ее заключается в том, что взаимодействие между антителом и антигеном происходит только в присутствии белков комплимента, которые адсорбируются на поверхности образовавшегося комплекса АГ-АТ.

Сами антигены, после присоединения комплемента, подвергаются существенным изменениям, которые и показывают качество проведенной реакции. Это может быть лизис, гемолиз, иммобилизация, бактерицидное или бактериостатическое действие.

Сама реакция происходит в две фазы:

1. Образование комплекса антиген-антитело, которое визуально не заметно исследователю.
2. Изменение антигена под действием комплемента. Эта фазу чаще всего можно отследить невооруженным глазом. Если же визуально реакции не видно, то используют дополнительную индикаторную систему, позволяющую выявить изменения.

Индикаторная система

Данная реакция основана на связывании комплемента. В исследуемую пробирку спустя час после постановки РСК добавляют очищенные эритроциты барана и гемолитическую сыворотку, не содержащую комплемента. Если в пробирке остался несвязанный комплемент, то он присоединится к комплексу АГ-АТ, образованному между бараньими клетками крови и гемолизином, и вызовет их растворение. Это будет означать, что РСК отрицательна. Если эритроциты остались целыми, то, соответственно, реакция положительная.

Реакция гемагглютинации (РГА)

Существуют две принципиально разные реакции гемагглютинации. Одна из них - серологическая, она используется для определения групп крови. В этом случае эритроциты взаимодействуют с антителами.

А вторая реакция не относится к серологическим, так как красные кровяные тельца реагируют с гемагглютининами, продуцируемыми вирусами. Так как каждый возбудитель действует только на конкретные эритроциты (куриные, бараньи, обезьяньи), то можно считать эту реакцию узкоспецифичной.

Понять, положительная реакция или отрицательная, можно по расположению клеток крови на дне пробирки. Если их рисунок напоминает перевернутый зонтик, значит, искомый вирус присутствует в крови больного. А если все эритроциты сложились наподобие монетного столбика, то искомых возбудителей нет.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Это высокоспецифичная реакция, позволяющая установить вид, тип вирусов или наличие специфических антител в сыворотке крови пациента.

Суть ее заключается в том, что антитела, добавленные в пробирку с исследуемым материалом, препятствую осаждению антигенов на эритроцитах, тем самым останавливая гемагглютинацию. Это и является качественным признаком наличия в крови специфических антигенов к конкретному искомому вирусу.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

В основе реакции лежит способность выявлять комплексы АГ-АТ при после их обработки флюорохромными красителями. Это метод прост в обращении, не требует выделения чистой культуры и занимает мало времени. Он незаменим для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.

В практике эти серологические реакции делятся на два вида: прямые и непрямые.

Прямая РИФ производится с антигеном, который заранее обработан флюоресцирующей сывороткой. А непрямая заключается в том, что сначала препарат обрабатывают обычным диагностикумом, содержащим антигены к искомым антителам, а затем повторно наносится люминесцентная сыворотка, которая специфична к белкам комплекса АГ-АТ, и микробные клетки становятся заметны при микроскопии.