Основными в этиологической лабораторной диагностике микозов до настоящего времени продолжают оставаться классические методы, включающие микроскопию материала, выделение чистой культуры возбудителя с последующей его идентификацией. Иммунологические методы диагностики имеют вспомогательное значение. Они используются для выявления наиболее значимых возбудителей: патогенных диморфных грибов, а также возбудителей криптококкоза, кандидоза и аспергиллеза. Методы геноиндикации (полимеразная цепная реакция) также имеют ограниченное применение ввиду их недостаточной специфичности, но применяются преимущественно при диагностике глубоких и оппортунистических микозов.

Материалом для исследования при лабораторной диагностике микозов в зависимости от формы заболевания могут быть: кожа и ее придатки (волосы, ногти), отделяемое ран и свищей, мокрота, кровь, ликвор и моча, тканевые биоптаты. Правильностью взятия патологического материала во многом определяется эффективность дальнейшего лабораторного исследования. При кожных поражениях материал отбирается чаще всего методом соскобов или с использованием липкой ленты (преимущественно при поверхностных формах) до лечения из свежих, но полностью развившихся очагов по периферии, где находятся наиболее жизнеспособные возбудители.

При выявлении грибов-дерматофитов чрезвычайно информативным материалом являются волосы, поскольку характер поражения волос позволяет идентифицировать возбудителя. Определению очага поражения в ряде случаев помогает использование лампы Вуда. Пораженные волосы вместе с чешуйками извлекаются эпиляционным пинцетом. При хронической черноточечной трихофитии волосы извлекают из кожи препарировальной иглой.

Ногти отбирают на протяжении всех слоев, срезая острым скальпелем или ножницами. Более эффективен отбор с использованием зубного бура. При кандидозных поражениях материал отбирается с помощью соскоба с ногтевого валика. Отобранный материал доставляется в лабораторию в пакетах из темной бумаги, чтобы избежать высыхания и контаминации посторонней микрофлорой. Материал, содержащий гной, доставляется в стерильных бакпечатках или чашках Петри. Мокрота отбирается в стерильную посуду. Исследование мокроты должно быть проведено не позднее 2 ч после сбора. При удлинении сроков исследования образцы должны храниться в холодильнике при + 4 °С, в противном случае могут возникнуть диагностические ошибки, связанные с появлением псевдомицелиальных форм дрожжевых клеток.

Кровь и спинномозговая жидкость отбираются с соблюдением правил асептики. Посев крови осуществляется в жидкую среду Сабу- ро. Для исключения контаминации образцов крови проводят их повторные исследования. Спинномозговую жидкость центрифугируют, а осадок используют для микроскопирования и посева.

Моча отбирается утром в стерильную посуду, при этом необходимо избегать загрязнения материала микрофлорой кожи промежности. Посев мочи осуществляется с использованием количественных методов посева.

В диагностике микозов используются препараты как из нативного материала, так и окрашенные. При исследовании неокрашенных препаратов плотный материал предварительно просветляют (мацери- руют) 10-30% раствором КОН (можно использовать растворы диметил сульфоксида), а затем микроскопируют по методу «раздавленной капли». Для придания контрастности препараты прокрашивают водным раствором метиленового синего.

Окраску фиксированных мазков осуществляют различными способами: по Граму, метиленовым синим, по Романовскому - Гим- зе. Последний способ позволяет увидеть мелкие дрожжевые клетки и стадии фагоцитоза. Для криптококков используют окраску тушью, окраску с муцикармином по Саутгейту. Меланинсодержащие грибы (темноокрашенные), например Cladophialophora bandana , окрашивают по Массой - Фонтана (окраска меланина, входящего в состав клеточной стенки). Флюоресцирующие сыворотки используются при диагностике возбудителей глубоких микозов, возбудителей дерматофи- тии, грибов рода Candida.

Выделение чистой культуры возбудителя дает возможность установить родовую и видовую принадлежность гриба, изучить его свойства и чувствительность к антимикробным препаратам. Для выделения и идентификации грибов используют плотные и жидкие питательные среды Сабуро, сусло-агар. Эти среды обеспечивают рост большинства патогенных и условно-патогенных грибов. Кроме того среда Сабуро (рис. 8.2) стимулирует процессы пигментообразования у грибов, что имеет значение при идентификации.

Для подавления роста бактерий-контаминантов в среды добавляют антибиотики: левомицетин, стрептомицин, пенициллин, тетрациклин. Для выделения прихотливых патогенных грибов используют среды, обогащенные кровью и сердечно-мозговым экстрактом. Специальные среды используют для культивирования и идентификации грибов: среда Чапека - для формирования конидий при идентификации плесневых грибов, картофельный (картофельно-морковный) агар, рисовый агар - для выявления типов роста и получения хламидоспор при идентификации грибов рода Candida , морковный (овощной) агар - для получения типичных колоний культуры гриба Trichophyton schonleini, среда Кашкина - для выделения пигментообразующих грибов. Используются и дифференциально-диагностические среды, например, для идентификации С. albicans - хромогенные среды или среды, позволяющая определить фосфолипазную активность гриба.

Время инкубации грибов составляет от нескольких суток до 1 месяца и более. При подозрении на патогенные диморфные грибы для выдачи отрицательного ответа культивирование проводится в течение 8 недель.

Посевы проводят на среды, разлитые по пробиркам, флаконам и чашкам Петри. Посевы материала на грибы-дерматофиты осуществляют одновременно на несколько пробирок со средой. Материалы, подозрительные на содержание плесневых грибов (мокрота), засевают в 3 точки и инкубируют при 28 и 37 °С. Для решения вопроса об отсутствии контаминации при заборе материала осуществляют контрольные посевы воздуха на содержание плесневых грибов в помещениях лаборатории и палатах, где находятся больные.

При культивировании грибов в микологической лаборатории соблюдаются меры безопасности, аналогичные таковым в бактериологических лабораториях. Работу с плесневыми грибами и микотоксинами во избежание аллергизации персонал проводит в боксированных помещениях в марлевых повязках или в настольных боксах с вытяжкой. Работа с культурами, относящимися ко II группе патогенности (патогенные диморфные грибы), возможна только в специализированных лабораториях.

Идентификация видов грибов проводится на основании комплекса культуральных, морфологических и других признаков. К первым относятся морфология колонии, ее окраска и размеры при культивировании на специальных средах, строение края и центра, характер поверхности, наличие и характер репродуктивных органов, ко вторым - особенности микроскопического строения мицелия, строение, форма и размеры репродуктивных органов - конидиеносцев, конидий, хламидоспор, артроспор и т.д.

Грибы формируют различные типы колоний на плотных питательных средах. Ученые из института Г. Вентера (США), учитывая способность грибов выделять в среду пигментные вещества, создали в питательной среде «новогоднюю елку» (рис. 8.3).

Рис. 8.3. «Новогодняя елка» из грибов (верхушка: Talaromyces stipitatus ; дерево Aspergillus nidulans; украшения: Penicillium marneffei; пенек: Aspergillus terreus)

Ферментативные и ассимиляционные способности культур имеют большое значение при идентификации дрожжей (дрожжеподобных грибов). В настоящее время для идентификации часто встречающихся грибов - возбудителей заболеваний человека и животных - применяются коммерческие тест-системы: BBL Mycotube, API 20С bio Merieux и др.

Болезни, вызванные грибками или микозы, являются распространенной проблемой. Возбудителей микозов насчитывается невероятное количество.

Ежегодно открываются учеными и описываются новые виды грибков. Несмотря на это, диагностика и лечение микозов - давно отлаженный и четкий механизм.

Виды грибковых заболеваний

У человека большинство грибков поражают слизистые оболочки и кожу.

К болезням, при которых причиной развития заболевания являются грибки, относятся:

• дерматомикоз
• кандидоз
• онихомикоз
• пёстрый или отрубевидный, разноцветный лишай
• чёрный лишай
• себорея
• аспергиллёз

Методы диагностики микозов

Одна из самых популярных методик - микробиологическая диагностика микозов.

Современные методы диагностики позволяют точно определить, какой грибок был причиной возникновения болезни. В дальнейшем, это дает возможность подобрать оптимальный курс лечения. На данный момент существует три основных метода лабораторной диагностики микозов.

К ним относятся:

• микроскопический
• культуральный
• серологический

Каждый из методов имеет свои преимущества. Культуральная диагностика микозов позволяет определить вид грибков. При этом есть возможность оценить чувствительность колоний к различным препаратам.

Подобный метод позволит подобрать эффективный препарат. Данный способ требует много времени на посев и выращивание колоний.

Микроскопический и серологические методы диагностики микозов требуют меньше времени на проведение. При их использовании тоже определяется вид возбудителя, но проверить его чувствительность к препаратам невозможно. В некоторых случаях возможно использование люминесцентного метода диагностики. Данный метод менее распространен ввиду его сложности.

Люминесцентный метод возможно применять лишь при поражении грибками волос. Метод малоэффективен для диагностики на ранних стадиях. Это обусловлено тем, что эффект свечения будет проявляться лишь при обильном поражении грибком волос.

Диагностика микоза стопы

Микоз стопы является одним из наиболее распространенных дерматомикозов.

Под этим термином принято понимать грибковое поражение кожи стопы и ногтей.

Помните! Заболевание отличается рецидивирующим течением.

Во время диагностики микоза стопы необходимо провести дифференциацию с рядом иных заболеваний. Диагностика микоза стопы базируется на клинических проявлениях и микроскопическом исследовании. Возможно применение культурального метода.

Лечение микозов

Ведущую роль в лечении микозов составляют противогрибковые препараты местного и системного действия.

Лечение местными антимикотиками направлено непосредственно на очаг заболевания. При этом негативное воздействие на организм в целом является минимальным.

Противомикозные препараты системного действия назначают, если:

• местные противогрибковые препараты малоэффективны
• заболевание имеет системный характер

Десенсибилизирующее и антигистаминные препараты назначают, когда микозы сопровождаются воспалительным процессом или аллергическими реакциями. Если к микозам присоединяется вторичная инфекция, возможно назначение антибактериальных препаратов.

Лечение грибковых заболеваний важно начинать на ранних стадиях болезни. Если процесс давний, для лечения может потребоваться больше времени.

При появлении первых симптомов незамедлительно обращайтесь за помощью к нашему врачу.

Первый прием

На приеме миколог проводит осмотр, а также назначает комплексное исследование.

Лабораторная диагностика

Самыми эффективными методами диагностирования микозов кожи являются различные лабораторные исследования, которые способны выявить возбудителя и помочь в подборе схемы терапии. Для выявления возбудителя микоза назначают такие лабораторные исследования:

• гистологический анализ;
• бактериологический посев;
• иммунологическое исследование;
• ПЦР-диагностирование;
• культуральное обследование;
• микробиологические исследования.

Микробиологическая диагностика помогает обнаружить гриб, определить его род и вид.

Микробиологическая диагностика является наиболее распространенным и самым простым методом выявления микоза в крови и на коже. Для выявления точного диагноза, следует знать, как правильно собирать материал, который необходим при исследовании. Пораженные волосы следует собирать при помощи пинцета. Если инфицирована кожа, то для микроскопии следует соскоблить с поврежденного участка кожный покров. Весь забранный материал помещают в 30% раствор гидроксида калия, а затем на предметное стекло. Микробиологическая диагностика способна выявить, где именно расположен грибок (внутри или снаружи волоса, кожи) и его размеры.

Чтобы предотвратить ошибочный диагноз микоза, следует правильно и грамотно забирать материал для микробиологического обследования.

В медицине существуют такие методы микробиологической диагностики:

• Микроскопия с применением нативных или неокрашенных препаратов. Для этого материал осветляют с помощью 10-30% растворов гидроксида калия или натрия. Затем обработанный материал кладут на лабораторное стеклышко, куда предварительно накапали немного глицерины. Сверху прикрывают стеклянной пластинкой и проводят анализ.
• Микроскопию окрашенных препаратов проводят несколькими способами, которые идентифицируют бактерии, дифференцируют различные бактерии и выявляют разные грибы.

Бактериологический посев

Бактериологический посев – один из самых эффективных методов для диагностики.

Сбор бактериологического посева на питательную среду является точным способом диагностики микоза. Учитывая внешний вид и характеристики выросшей колонии грибка, дерматолог устанавливает тип возбудителя, вызвавшего микоз. Единственный минус обследования в том, что требуется много времени, чтобы вырастить колонию. В среднем необходимо около 3-х недель, чтобы выяснить штамм возбудителя. В некоторых случаях метод не приносит ожидаемых результатов.

ПЦР-диагностика

Метод ПЦР-диагностирования предполагает выявление возбудителя микоза с применением полимеразной цепной реакции. При обследовании увеличивается чувствительность гибридизации, что повышает содержимое вирусного ДНК в исследуемом материале. Этот метод обследования является новым и требует нескольких анализов от пациента. Считается, что такой вид диагностики достаточно затратный, но дает точные результаты.

Культуральное обследование

Культуральные диагностические мероприятия рекомендуются на финальном этапе постановки диагноза. Метод заключается в получении культуры грибка, которая потом отправляется на обследование с помощью микроскопа. Полученный материал кладут на искусственно созданную питательную среду и выявляют род возбудителя, внешний вид, размеры. После чего показано специальное лечение, которое направлено на борьбу с конкретным видом возбудителя микоза.

Микроскопия – это один из основных методов в лабораторной диагностике микозов. Проводить это исследование необходимо с того дня, когда на питательной среде появляются первые колонии. Перед микроскопическим исследованием необходимо знать является гриб дрожжевым или плесневым – по внешнему виду колоний, результатам проростковой пробы.

При микроскопии плесневых грибов учитывают структуру мицеллия (т.е. особенности строения гиф, их цвет, септированность; особенности строения конидиев и спор, включая размер, форму, цвет конидиев; строение их клеточной стенки, септированность и т.д.)

Для проведения микроскопии готовят нативные и окрашенные препараты. Для приготовления окрашенных препаратов материал обрабатывают различными способами:

1. Окраска PAS -методом. Использование РAS-метода позволяет выявить нейтральные полисахариды в стенках микроорганизмов. Нейтральные полисахариды – это глюкан-маннановый комплекс, находящийся в клеточной стенке большинства эумицетов, за счет него и происходит окрашивание.

PAS -реакции – один из методов микроскопической диагностики тканевых форм грибковой инфекции. В практических лабораториях для микроскопической диагностики используются различные модификации этого метода: окисление хромовой кислоты – реакция Бауэра; окраска по Гридли.

2. Окраска по методу Грама (модификация по Грам-Вайгерту) для выявления сопутствующих микроорганизмов.

3. Окраска по Циль-Нильсону для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов. Если исследуемый материал жидкий , то из него готовят неокрашенный мазок для микроскопии в просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином в соотношении 1:1.

Следующий этап это микологическое исследование – выделение и идентификация грибов. Рассмотрим особенности этого этапа в зависимости от исследуемого материала.

Микологическое исследование

Культуральное исследование. Культуральное исследование основано на выделение возбудителя из исследуемого материала. Сроки культивирования различны для разных видов грибов (от 2-4 дней до 4 недель), при подозрении на диморфные грибы культуру выделяют до 8 недель. Основными средами для культивирования в микологической лаборатории является среда Сабуро: декстрозный агар Сабуро (плотная среда), бульон Сабуро (жидкая среда). Для подавления роста бактериальной флоры в среду Сабуро добавляют антибиотики (хлорамфеникол, гентамицин, реже стрептомицин, пенициллин). Для подавления роста сапрофитных грибов в среду добавляют циклогексимид, хлорамфеникол. Существуют готовые среды с циклогексимидом (Mycobiotic Mycosel ).

Оптимальным режимом культивирования для большинства патогенных грибов является 30 0 С, 20-25 0 С, реже 37 0 С – при подозрении на диморфные грибы. Длительность инкубации для большинства грибов составляет до 6 недель; если по прошествию этого времени роста не наблюдается, то дают отрицательный ответ. В случае подозрения на диморфный микоз при отсутствии роста в течение 6 недель, культуру выдерживают 8 недель и только после этого дают отрицательный результат.

При культуральном исследовании диагностически значимым являются:

Выделение плесневого или дрожжевого гриба, при исследовании стерильного в норме материала;

Выделение диморфного гриба.

Алгоритм микологического исследования

1. Определение грибковой этиологии возбудителя (микроскопия).

2. Определяют дрожжевой гриб или плесневый:

Микроскопия клинического материала (наличия мицеллия);

Характер колоний на питательной среде, скорость роста (дрожжевые грибы растут 48 часов, плесневые грибы растут медленно).

3. Окончательную идентификацию гриба до уровня вида (внутривидовая) проводят с использованием биохимических тестов и иммунологических методов. При исследовании биохимических свойств изучают способность выделенной культуры к ассимиляции (ауксанограмма) и ферментации (зигограмма). Возможно использование автоматизированных систем идентификации (тест-системы для идентификации грибов).

Критерии этиологической значимости выделения условно-патогенных грибов

1.Если в нативном препарате видны только бластоспоры (сапрофитная вегетация) то это расценивается как носительство.

3.Если бластоспоры единичные и преобладает псевдомицелий, то это признак глубоких органных поражений.

4.Активное почкование бластоспор – свидетельство острого процесса.

5.Количественную оценку результатов – выделение гриба из разведений

10 -фекалии, моча;

10 – мокрота.

6.Повторность высеваемости одного и тогоже вида гриба

7. Наличие антител к выделенному штамму.

Микологическое исследование отделяемого слизистых

1. Подготовка материала. После забора материала со слизистых тампон помещают в 2 мл жидкой среды Сабуро или сусло-агара, или МПБ, разлитого в стерильные пробирки. Их тщательно встряхивают в течение 5 минут, стараясь не замочить пробку. Из полученной взвеси готовят ряд разведений 1:10 и 1:100 и т.д.

Из каждого разведения высевают по 0,1мл на 2 чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА. Посевы на плотных средах и пробирку с жидкой средой с тампоном для обогащения инкубируют при +37 0 С в течение 48 часов:

После пройденного времени посевы просматривают и подсчитывают число колоний и ориентировочно определяют количество дрожжевых колоний. Их количество умножают на 20 и на разведение, из которого сделан высев;

Если на чашках с посевом, сделанным из разведений роста нет, то делают повторный посев из среды обогащения в чашку с сусло-агаром.

Микологическое исследование крови

1. Подготовка материала. После забора крови ее разводят 1:10, для того, чтобы бактерицидные свойства крови не ингибировали рост грибов.

2. Культуральное исследование.

5-10мл крови засевают в 50-100 мл жидкой среды Сабуро с 2% глюкозой. При температуре 37 0 С их инкубируют в течение недели;

Через 5 дней делают контрольный высев. Для этого стерильной пипеткой забирают осадок 3-4 капли из пипетки засевают на сусло-агар и растирают стерильной бактериологической петлей;

Засеянные чашки в течение 2-5 дней держат в термостате при 37 0 С;

Если обнаружен рост, то выдают предварительный ответ о фунгемии, а дальнейшую идентификацию гриба проводят в ходе исследования.

Микологическое исследование биоптатов

1.Для забора материала используют метод отпечатков.

2. Культуральное исследование:

Делают отпечаток исследуемым кусочком ткани на поверхность плотной питательной среды Сабуро;

Этот же кусочек ткани помещают в 50мл жидкой питательной среды (сусло или Сабуро);

Посевы инкубируют при 37 0 С в течение 5 дней.

Прецизионная диагностика инвазивных микозов нелегка. Это объясняется не только трудностями в получении культуры грибов, но и в интерпретации результатов исследований, поскольку грибами, как дрожжевыми, так и мицелиальными, возможны колонизация слизистых оболочек, контаминация исследуемых образцов. В связи с этим диагностика инвазивных микозов базируется на комплексном подходе, включающем не только результаты микологических (культуральных) и серологических (определение антигена грибов) исследований, но и клинические симптомы грибковой инфекции, данные вспомогательных методов исследований (компьютерная или магнитно-резонансная томография, ультразвуковое исследование).

Европейско-американской кооперированной группой по изучению инвазивных микозов у иммунокомпрометированных больных разработаны критерии диагностики инвазивных микозов. Они представлены в 2001 г. на Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (ICAAC, Chicago), а в 2002 г. в печати. Определены критерии доказанного, вероятного и возможного инвазивного микоза, которые рекомендуется использовать при клинических и эпидемиологических исследованиях

Доказанный инвазивный микоз, вызванный мицелиальными грибами : обнаружение мицелия грибов в биоптатах либо аспиратах при гистологическом или цитологическом исследовании или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи и со слизистых оболочек.

Доказанный инвазивный микоз, вызванный дрожжевыми грибами : обнаружение дрожжевых клеток (грибы рода Candida могут формировать псевдомицелий или истинный мицелий) в биоптатах или аспиратах, за исключением образцов со слизистых оболочек, или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи, образцов из пазух носа и со слизистых оболочек, или обнаружение при микроскопии и специфическом окрашивании (в капле туши, окраска муцикармином) дрожжевых клеток либо положительного антигена Cryptococcus spp. в цереброспинальной жидкости.

Фунгемия, обусловленная мицелиальными грибами : выделение гемокультуры грибов, за исключением Aspergillus spp. и Penicillium spp., включая Penicillium marneffei, в сочетании с клиническими симптомами инфекционного процесса, совместимыми с выделенным возбудителем.

Фунгемия, обусловленная дрожжевыми грибами : выделение гемокультуры грибов рода Candida или иных дрожжевых грибов у пациентов с клиническими признаками инфекции, связанными с данным возбудителем.

Комплекс диагностических исследований при инвазивных микозах

Исследуемый биоматериал	Показания, используемые среды, значение
Кровь	Показания : стойкая лихорадка (4-5 дней и более) на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия; вторая «волна» лихорадки на фоне терапии антибиотиками Забор крови из вены во флаконы для аэробных бактерий* или в селективную среду для грибов, неоднократный (2-3 раза в течение суток с интервалом 1 ч) Диагностическая значимость : выделение дрожжевых грибов, осторожная интерпретация при выделении мицелиальных грибов, за исключением Fusarium spp.
Венозный катетер	Показания : выделение дрожжевых грибов из крови Центральный или периферический венозный катетер удаляют во всех случаях выделения дрожжевых грибов из крови Для микологического исследования используют асептически удаленный дис-тальный отрезок катетера длиной 5- 6 см. Исследование проводят полуколичественным (Maki method) или количественным методом на среде Сабуро Диагностическая значимость : выделение дрожжевых грибов при полуколичественном исследовании 15 КОЕ или более, при количественном - 103КОЕ/мл или более для подтверждения диагноза катетерассоциированной инфекции или инфицирования катетера
Отделяемое верхних дыхательных путей, мокрота, смывы из трахеи, бронхов, жидкость бронхоальвеолярного лаважа	Показания : подозрение на микозы, вызванные мицелиальными грибами или Cryptococcus neoformans; длительная лихорадка на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия и нейтропении Микроскопия образцов с калькофлуором белым (обнаружение мицелия или псевдомицелия); посев на среду Сабуро; определение антигена Aspergillus в жидкости бронхоальвеолярного лаважа при наличии очагов в легких, характерных для инвазивного аспергиллеза Диагностическая значимость : выделение мицелиальных грибов или Cryptococcus neoformans
Цереброспинальная жидкость	Показания : симптомы менингита; обнаружение очага (очагов) в головном мозге при компьютерной или магнитно-резонансной томографии; «мозговая» симптоматика на фоне лихорадки и нейтропении Микроскопия с калькофлуором белым, в капле туши; определение антигена Aspergillus, Cryptococcus; посев на среду Сабуро Диагностическая значимость : обнаружение грибов как дрожжевых, так и мицелиальных; положительный антиген
Биоптаты, аспираты, перитонеальная жидкость, плевральная жидкость	Показания : клинические и/или радиологические признаки инвазивного микоза; лихорадка на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия. Микроскопия с калькофлуором белым, посев на среду Сабуро Диагностическая значимость : обнаружение грибов как дрожжевых, так и мицелиальных

* Частота выделения грибов из крови была идентичной при исходном взятии крови как во флаконы со средой для культивирования бактерий, так и с селективной средой для грибов. Изучение проведено на бактериологическом анализаторе ВАСТЕС 9240.

Вероятный инвазивный микоз диагностируют при совокупности следующих критериев:
один признак из категории микробиологических критериев;
один признак из категории «значимых» или два из группы «менее значимых» клинических симптомов инфекционного процесса.

Возможный инвазивный микоз диагностируют на основании совокупности следующих критериев:
наличие хотя бы одного фактора риска, индуцирующего развитие инвазивного микоза;
один признак из категории микробиологических критериев или один признак из категории «значимых» (два из группы «менее значимых») клинических симптомов инфекционного процесса.

Понятие «возможный инвазивный микоз » не рекомендуется использовать в клинических исследованиях по изучению эффективности протигрибковых препаратов. Можно пользоваться этим термином при анализе эмпирической противогрибковой терапии, эпидемиологических исследований, изучении фармакоэкономики.

При микологическом исследовании стерильных аспиратов или биоптатов принимают во внимание выделение не только культуры грибов, но и обнаружение при микроскопии мицелия или псевдомицелия. В гистологических препаратах аспергиллы трудно дифференцировать от Fusarium spp., Sceclosporium apiospermum и некоторых других мицелиальных грибов. Для дифференциальной диагностики следует проводить иммуногистохимическое исследование с антителами к аспергиллам.

Выделение дрожжевых грибов из крови хотя бы в одном исследовании относится к категории «доказанного» инвазивного микоза и является абсолютным показанием к назначению системных антимикотиков больным с нейтропенией. Частота выявления дрожжевых грибов из крови невысокая, даже при диссеминированном кандидозе она составляет 35-50 %.
Проведение повторных посевов крови повышает вероятность получения положительных результатов.

Иная интерпретация результатов в случае обнаружения мицелиальных грибов в крови. Высокая частота выделения мицелиальных грибов характерна для Fusarium spp. и составляет 40-60 %. Aspergillus обнаруживают крайне редко, в большинстве случаев это рассматривается как контаминация, за исключением Aspergillus terreus.

Выделение Aspergillus terreus из крови больных с гемобластозами может свидетельствовать об истинной аспергиллемии, а при наличии клинических симптомов инфекции является основанием для назначения антимикотиков.

Критерии инвазивного микоза

Показатель	Критерии
Факторы, индуцирующие возникновение инвазивного микоза (макроорганизм)	Нейтропения (< 0,5*109/л в течение 10 дней) Персистирующая лихорадка в течение более 96 ч на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия Температура тела выше 38 °С или ниже 36 °С и любой из следующих предрасполагающих признаков: длительная нейтропения (более 10 дней) в течение предыдущих 60 дней, интенсивная им-муносупрессивная терапия в течение последних 30 дней, доказанный или вероятный инвазивный микоз в предыдущий период нейтропении либо СПИД Наличие симптомов РТПХ, прежде всего случаи тяжелого течения (II степени) или экстенсивное течение хронической болезни Длительное (более 3 нед) применение глюкокортикоидов в течение последних 60 дней
Микробиологические признаки	Выделение культуры мицелиальных грибов (включая Aspergillus spp., Fusaruim spp., Sceclosporium spp. и зигомицеты) и Cryptococcus neqformans из мокроты или жидкости бронхоальвеолярного лаважа Положительные результаты культурального или цитологического исследования (прямой микроскопии) по обнаружению мицелиальных грибов из аспиратов придаточных пазух носа Обнаружение мицелиальных грибов или Cryptococcus neoformans при цитологическом исследовании/ прямой микроскопии из мокроты или жидкости бронхоальвеолярного лаважа Положительный антиген Aspergillus в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, цереброспинальной жидкости и образцах крови (не менее двух) Положительный антиген криптококка в образцах крови Обнаружение при цитологическом исследовании или прямой микроскопии элементов грибов в образцах стерильных в норме жидкостей (например, Cryptococcus spp. в цереброспинальной жидкости) Два положительных результата исследований по обнаружению культуры дрожжевых грибов в моче при отсутствии мочевого катетера Кристаллы Candida в моче при отсутствии мочевого катетера Выделение Candida spp. из гемокультур
Клинические признаки Нижние дыхательные пути	Должны быть сопряжены с локусом, откуда берут образцы для микробиологического исследования Любой из следующих типов новых инфильтратов в легких по данным КТ: симптом «ореола», симптом «полумесяца», полость с участками консолидации* Симптомы инфекции нижних дыхательных путей (кашель, боль в грудной клетке, кровохарканье, диспноэ), шум трения плевры, любой новый инфильтрат, не включенный в признаки высокой степени значимости; плевральный выпот
Верхние дыхательные пути Признаки высокой степени значимости Признаки меньшей степени значимости	Радиологические признаки инвазивной инфекции в пазухах носа (эрозия стенки или распространение инфекции на прилежащие структуры, экстенсивная деструкция костей черепа) Насморк, заложенность носа, изъязвления слизистой оболочки носа, носовое кровотечение, периорбитальный отек, боль в области верхней челюсти, некротические изъязвления черного цвета или перфорация твердого неба
Центральная нервная система Признаки высокой степени значимости Признаки меньшей степени значимости	Рентгенологические признаки предполагаемой инфекции ЦНС (мастоидит или другой параменингеальный фокус, экстрадуральная эмпиема, множество очагов в веществе головного или спинного мозга) Фокальные неврологические симптомы и признаки, включая фокальные судороги, гемипарез; расстройства сознания, менингеальные симптомы, нарушения биохимического состава цереброспинальной жидкости и ее клеточного состава (при отсутствии других возбудителей, по данным культурального исследования и микроскопии, при отсутствии опухолевых клеток)

*При отсутствии инфекции, обусловленной микроорганизмами, способными вызвать аналогичную радиологическую картину, включая образование полостей (Mycobacterium spp., Legionella spp., Nocardia spp.).

При выявлении в крови или иных стерильных биосубстратов дрожжевых грибов обязательно следует проводить идентификацию до вида и определять чувствительность к противогрибковым препаратам, при выделении мицелиальных (плесневых) грибов - только идентификацию до вида, чувствительность не определяют.

В клинической практике чувствительность мицелиальных грибов не исследуют по причине несовершенства стандартов по определению чувствительности таких грибов к антимикотикам. Более того, только в одном исследовании продемонстрирована корреляция между чувствительностью Aspergillus spp. и результатами лечения инвазивного аспергиллеза у больных с гемобластозами. Ни в одном из исследований, проведенных в последующем, не получено подобных результатов.

В последнее время стали появляться единичные сообщения о формировании приобретенной резистентности грибов A. fumigatus к итраконазолу, вориконазолу.

Идентификация грибов до вида , особенно полученных из стерильных локусов, необходима прежде всего для выбора антимикотика и проведения адекватной противогрибковой терапии. Так, Candida krusei устойчивы к флуконазолу и менее чувствительны, чем дрожжевые грибы другого вида, к амфотерицину В; Aspergillus terreus, Scedosporium apiospermum (Pseudallescheria boydii), Trichosporon beigelii, Scopulariopsis spp. резистентны к амфотерицину В; Mucorales резистентны к итраконазолу, вориконазолу, Candida glabrata проявляет дозозависимую чувствительность к флуконазолу, и при выделении этого вида гриба, даже чувствительных штаммов, дозу флуконазола следует увеличить (взрослым назначают 800 мг вместо 400 мг); Candida lusitaniae устойчивы к амфотерицину В.

Идентификация грибов до вида также важна для проведения эпидемиологического анализа в стационаре - определения возбудителей вспышек инфекции и по возможности источника инфекции. Описаны вспышки инфекции, вызванные такими редкими грибами, как С. lusitaniae, С. krusei, С. lipolytica.

На основании видовой идентификации грибов можно предположить инвазивный микоз или колонизацию грибами слизистых оболочек. Например, Aspergillus niger существенно реже, чем Aspergillus fumigatus, являются причиной инвазивного аспергиллеза у больных острыми лейкозами. Выделение из жидкости бронхоальвеолярного лаважа Aspergillus niger чаще всего расценивается как колонизация дыхательных путей, а из мокроты - как контаминация из воздуха и требует дополнительных исследований при подтверждении диагноза инвазивного аспергиллеза.

На основании выделения мицелиальных грибов из мокроты, бронхоальвеолярной жидкости, аспирата околоносовых пазух можно только предполагать инвазивный микоз, не включая его в категорию «доказанного». Тем не менее обнаружение Aspergillus в мокроте, особенно Aspergillus fumigatus или Aspergillus flavus, у пациентов с нейтропенией, реципиентов аллогенного костного мозга всегда должно быть принято во внимание. Это требует повторного проведения микологического исследования и компьютерной томографии легких. Так, при нейтропении вероятность выявления инвазивного аспергиллеза в случае положительной культуры Aspergillus spp. в мокроте составляет 80 %.

Выделение Cryptococcus neoformans у иммунокомпрометированных больных из респираторного тракта (смывы, лаваж) является диагностически значимым. Если идентификация дрожжевых грибов из жидкостей, полученных из дыхательных путей (смывы из трахеи, бронхов, бронхоальвеолярный лаваж) иммунокомпрометированных больных, не относится к обязательным исследованиям, то проведение скрининга по выявлению Cryptococcus neoformans из этих образцов является необходимым.

Обнаружение кандид в моче у больных с нейтропенией и лихорадкой, как правило, считается проявлением диссеминированной кандидозной инфекции.

В своевременной диагностике инвазивного успешно пользуются коммерческим тестом по выявлению циркуляции специфического антигена грибов Aspergillus spp. галактоманна (полисахаридный водорастворимый компонент клеточной стенки гриба).

Галактоманн может быть определен двумя методами: методом латекс-агглютинации (Pastorex Aspergillus, фирмы BioRAD) и методом иммуноферментного анализа (Platelia Aspergillus, фирмы BioRAD).

Преимуществом иммуноферментного метода является более низкий порог чувствительности определения уровня галактоманна в крови - 1 нг/мл и менее, а с помощью латекс-агглютинации - 15 нг/мл. Диагностическое значение имеет определение галактоманна в крови (не менее чем в 2 образцах), цереброспинальной жидкости, бронхоальвеолярном лаваже. Чувствительность метода иммуноферментного анализа составляет около 90 %, специфичность 90-99 %, у реципиентов аллогенного костного мозга данные показатели ниже и равны соответственно 60-70 % и 80-90 % вследствие профилактического применения противогрибковых препаратов (антимикотики снижают пороговый уровень галактоманна).

В 40 % случаев выявление галактоманна в крови опережает проявления инвазивного аспергиллеза, определяемые при компьютерном исследовании легких, а в 70 % опережает клинические симптомы инфекции.

Диагностическую значимость тест по выявлению антигена Aspergillus имеет в том случае, если исследование проводят неоднократно. Определение антигена Aspergillus в крови следует проводить при лихорадке на фоне лечения антибиотиками широкого спектра действия у больных с нейтропенией 2 раза в неделю; при пневмониях, которые возникают или сохраняются на фоне антибактериальной терапии; при обнаружении очагов в легочной ткани (компьютерная томография).