Современный метод цитогенетического анализа, позволяющий определять качественные и количественные изменения хромосом (в том числе транслокации и микроделеции) и используемый для дифференциальной диагностики злокачественных заболеваний крови и солидных опухолей.

Синонимы русские

Флуоресцентная гибридизация in situ

FISH-анализ

Синонимы английские

Fluorescence in-situ hybridization

Метод исследования

Флуоресцентная гибридизация in situ.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Образец ткани, образец ткани в парафиновом блоке.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH, от англ. fluorescence in - situ hybridization) – это один из самых современных методов диагностики хромосомных аномалий. Он основан на использовании ДНК-проб, меченных флуоресцентной меткой. ДНК-пробы представляют собой специально синтезированные фрагменты ДНК, последовательность которых комплементарна последовательности ДНК исследуемых аберрантных хромосом. Таким образом, ДНК-пробы различаются по составу: для определения разных хромосомных аномалий используются разные, специфические ДНК-пробы. ДНК-пробы также различаются по размеру: одни могут быть направлены к целой хромосоме, другие – к конкретному локусу.

В ходе процесса гибридизации при наличии в исследуемом образце аберрантных хромосом происходит их связывание с ДНК-пробой, которое при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как флуоресцентный сигнал (положительный результат FISH-теста). При отсутствии аберрантных хромосом несвязанные ДНК-пробы в ходе реакции "отмываются", что при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как отсутствие флуоресцентного сигнала (отрицательный результат FISH-теста). Метод позволяет оценить не только наличие флуоресцентного сигнала, но и его интенсивность и локализацию. Таким образом, FISH-тест – это не только качественный, но и количественный метод.

FISH-тест обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами цитогенетики. В первую очередь, исследование FISH может быть применено как к метафазным, так и к интерфазным ядрам, то есть к неделящимся клеткам. Это основное преимущество FISH по сравнению с классическими способами кариотипирования (например, окрашиванием хромосом по Романовскому-Гимзе), которые применяются только к метафазным ядрам. Благодаря этому исследование FISH является более точным методом для определения хромосомных аномалий в тканях с низкой пролиферативной активностью, в том числе в солидных опухолях.

Так как в FISH-тесте используется стабильная ДНК интерфазных ядер, для исследования могут быть использованы самые различные биоматериалы – аспираты тонкоугольной аспирационной биопсии, мазки, аспираты костного мозга, биоптаты и, что немаловажно, сохраненные фрагменты ткани, например гистологические блоки. Так, например, FISH-тест может быть с успехом выполнен на повторных препаратах, полученных из гистологического блока биоптата молочной железы при подтверждении диагноза "аденокарцинома молочной железы" и необходимости определения HER2/neu-статуса опухоли. Следует особо подчеркнуть, что в данный момент исследование FISH рекомендовано в качестве подтверждающего теста при получении неопределенного результата иммуногистохимического исследования опухоли на онкомаркер HER2/neu(ИГХ 2+).

Другим преимуществом FISH является его способность определять микроделеции, которые не выявляются с помощью классического кариотипирования или ПЦР. Это имеет особое значение при подозрении на синдром Ди Джорджи и велокардиофациальный синдром.

FISH-тест широко используется в дифференциальной диагностике злокачественных заболеваний, в первую очередь в онкогематологии. Хромосомные аномалии в сочетании с клинической картиной и данными иммуногистохимического исследования являются основой классификации, определения тактики лечения и прогноза лимфо- и миелопролиферативнх заболеваний. Классическими примерами являются хронический миелолейкоз – t (9;22), острый промиелоцитарный лейкоз – t (15;17), хронический лимфолейкоз – трисомия 12 и другие. Что касается солидных опухолей, наиболее часто FISH-исследование применяется при диагностике рака молочной железы, мочевого пузыря, толстой кишки, нейробластомы, ретинобластомы и других.

Исследование FISH также может быть использовано в пренатальной и преимплантационной диагностике.

FISH-тест часто проводят в сочетании с другими методами молекулярной и цитогенетической диагностики. Результат этого исследования оценивают в комплексе с результатами дополнительных лабораторных и инструментальных данных.

Для чего используется исследование?

• Для дифференциальной диагностики злокачественных заболеваний (крови и солидных органов).

Когда назначается исследование?

• При подозрении на наличие злокачественного заболевания крови или солидных опухолей, тактика лечения и прогноз которых зависит от хромосомного состава опухолевого клона.

Что означают результаты?

Положительный результат:

• Наличие в исследуемом образце аберрантных хромосом.

Отрицательный результат:

• Отсутствие в исследуемом образце аберрантных хромосом.

Что может влиять на результат?

• Количество аберрантных хромосом.



• Иммуногистохимическое исследование клинического материала (с использованием 1 антитела)
• Иммуногистохимическое исследование клинического материала (с использованием 4 и более антител)
• Определение HER2 статуса опухоли методом FISH
• Определение HER2 статуса опухоли методом СISH

Кто назначает исследование?

Онколог, педиатр, акушер-гинеколог, врач-генетик.

Литература

• Wan TS, Ma ES. Molecular cytogenetics: an indispensable tool for cancer diagnosis. Anticancer Res. 2005 Jul-Aug;25(4):2979-83.
• Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, Kanavakis E, Mavrou A. Impact of cytogenetic and molecular cytogenetic studies on hematologic malignancies. Chang Gung Med J. 2012 Mar-Apr;35(2):96-110.
• Mühlmann M. Molecular cytogenetics in metaphase and interphase cells for cancer and genetic research, diagnosis and prognosis. Application in tissue sections and cell suspensions. Genet Mol Res. 2002 Jun 30;1(2):117-27.

Краткий ответ : Метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH - fluorescence in situ hybridization) включа­ет применение уникальных нуклеотидных после­довательностей ДНК в качестве зонда для поиска нужных последовательностей ДНК в материале, полученном от пациента. Метод основан на комплементарном связывании ДНК-зонда с ДНК метафазных хромосом или интерфазных клеток. ДНК-зонд и исследуемую ДНК денатурируют, образуется одноцепочная ДНК. ДНК-зонд до­бавляют к препарату хромосом, инкубируют определенное время. Присутствие или отсутствие меченного флюо­рохромом зонда в составе ДНК после гибридизации определяется при исследовании хромосом с помо­щью флюоресцентной микроскопии.

Развёрнутый ответ : Метод флуоресцентной гибридизации in situ позволяет выявлять индивидуальные хромосомы или их отдельные участки на препаратах метафазных хромосом или интерфазных ядрах на основе комплементарного взаимодействия ДНК-зонда, конъюгированного с флуоресцентной меткой и искомого участка на хромосоме. Для визуализации на хромосоме пептидно-нуклеиновых соединений применяют PNA-зонды на основе белкового продукта.
Метод основан на комплементарном связывании ДНК-зонда с ДНК метафазных хромосом или интерфазных клеток и включает следующие этапы:
1. Денатурация двухцепочечной ДНК зонда и ДНК мишени до одноцепочечных под воздействием высокой температуры или химических агентов.
2. Гибридизация ДНК-зонда с ДНК-мишенью по принципу комплементарности с образованием двухцепочечной гибридной молекулы
3. Постгибридизационная отмывка для удаления негибридизовавшегося ДНК-зонда
4. Анализ гибридизационных сигналов с люминисцентном микроскопе

Преимущества метода молекулярно-генетической диагностики FISH включают быстрый ана­лиз большого числа клеток, высокую чувствитель­ность и специфичность, возможность исследовать некультивируемые и неделящиеся клетки.
Недостатки метода заключаются в невозможности получить информацию о физическом состоянии исследу­емой ДНК или участка хромосомы.
FISH применяют в пренатальной молекулярно-генетической диагностике и для характеристики опухолей; в педиатрической практике его используют, как правило, для иденти­фикации субмикроскопических делеций, ассоции­рованных со специфическими пороками развития. Синдромы, в основе которых лежат микроделеции, раньше считались заболеваниями неизвестной этиологии, так как хромосомные делеции и пере­стройки, вызывающие развитие этих заболеваний, обычно не визуализируются при традиционных методах хромосомного анализа. Такие мелкие де­леции в специфических участках хромосом мож­но с большой точностью выявить методом FISH. К заболеваниям, обусловленным субмикроскопическими делециями, относятся синдромы Прадера-Вилли, Ангельмана, Вильямса, Миллера-Дикера, Смит-Мадженис и велокардиофациальный синдром . FISH облегчает диагностику этих синдромов в нетипичных случаях, особенно в младенческом возрасте, когда еще отсутствуют многие диагностически значимые признаки забо­левания. Применение этого метода молекулярно-генетической диагностики целесообразно также в подростковом и во взрослом возрасте, ког­да типичные клинические признаки заболевания, характерные для детского возраста, претерпевают изменения.

121. ДНК-зонды. Их применение в определении наследственных заболеваний.

Краткий обзор

ДНК – зонд - это короткий фрагмент ДНК, конъюгированный с флуоресцеином, ферментно, или радиоактивным изотопом, который используется для гибридизации с комплементарным участком молекулы ДНК – мишени.

Основная часть

Системы ДНК-диагностики

Информация о всем многообразии свойств организма заключена в его генетическом материале. Так, патогенность бактерий определяется наличием у них специфического гена или набора генов, а наследственное генетическое заболевание возникает в результате повреждения определенного гена. Сегмент ДНК, детерминирующий данный биологический признак, имеет строго определенную нуклеотидную последовательность и может служить диагностическим маркером.

В основе многих быстрых и надежных диагностических методов лежит гибридизация нуклеиновых кислот - спаривание двух комплементарных сегментов разных молекул ДНК. Процедура в общих чертах состоит в следующем.

1. Фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре.

2. Нанесение меченой одноцепочечной ДНК-зонда, которая при определенных условиях (температуре и ионной силе) спаривается с ДНК-мишенью.

3. Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшейся меченой ДНК-зонда.

4. Детекция гибридных молекул зонд/мишень.

В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. Система детекции должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной.

*Флуоресцеин (диоксифлуоран, уранин А) - органическое соединение, флуоресцентный краситель. В аналитической химии флуоресцеин используется в качестве люминесцентного кислотно-основного индикатора. В биохимии и молекулярной биологии изотиоцианатные производные флуоресцеина в качестве биологических красок для определения антигенов и антител.

* Детекция – это обнаружение, выявление, нахождение чего либо.

*конъюгирование=сопряжение

*Если в одной "пробирке" провести плавление и отжиг смеси ДНК, например, человека и мыши, то некоторые участки цепей ДНК мыши будут воссоединяться с комплементарными участками цепей ДНК человека с образованием гибридов. Число таких участков зависит от степени родства видов. Чем ближе виды между собой, тем больше участков комплементарности нитей ДНК. Это явление называется гибридизация ДНК-ДНК.

122. Методы и условия применения прямой ДНК-диагностики.

Краткий обзор:

С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100 %.

Целью прямой диагностики является идентификация мутантных аллелей (нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, мутации и их типы).

Недостатком метода прямой ДНК-диагностики является необходимость знания точной локализации гена и спектра его мутаций. Методы прямой ДНК-диагностики показаны для таких заболеваний, как фенилкетонурия (мутация R408W), муковисцидоз - (наиболее частая мутация delF508), хорея Гентингтона (экспансия тринуклеотидных повторов-CTG-повторы) и др.

Полный ответ:

С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100 %. Однако на практике указанные методы могут применяться при определенных условиях:

1) известной цитогенетической локализации гена, ответственного за развитие наследственного заболевания,

2) должен быть клонированным ген заболевания и известна его нуклеотидная последовательность.

Целью прямой диагностики является идентификация мутантных аллелей (нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, мутации и их типы). Высокая точность метода прямой ДНК-диагностики в большинстве случаев не требует ДНК-анализа всех членов семьи, так как выявление мутации в соответствующем гене позволяет почти со 100-процентной точностью подтвердить диагноз и определить генотип всех членов семьи больного ребенка, включая гетерозиготных носителей.

Недостатком метода прямой ДНК-диагностики является необходимость знания точной локализации гена и спектра его мутаций.

Методы прямой ДНК-диагностики показаны для таких заболеваний, как фенилкетонурия (мутация R408W), муковисцидоз - (наиболее частая мутация delF508), хорея Гентингтона (экспансия тринуклеотидных повторов-CTG-повторы) и др.

Однако к настоящему времени гены многих заболеваний не картированы, неизвестна их экзонно-интронная организация, и многие наследственные болезни отличаются выраженной генетической гетерогенностью, что не позволяет в полной мере использовать прямые методы ДНК-диагностики. Поэтому информативность метода прямой ДНК-диагностики широко варьирует. Так, при диагностике хореи Гентингтона, ахондроплазии она составляет 100 %, при фенилкетонурии, муковосицидозе, адреногенитальном синдроме - от 70 до 80 %, а при болезни Вильсона-Коновалова и миопатии Дюшенна/Бекера - 45-60 %. В связи с этим используются косвенные методы молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней.

Для лечения онкологических патологий ученные пока не разработали совершенных методов терапии, способствующих выздоровлению. Фиш-анализ при раке молочной железы дает надежду на ранее диагностирование заболевания. Метод позволит женщинам начать лечение на самых ранних этапах, что и повысит шансы на исцеление.

Что это такое?

Фиш-исследование при раке молочной железы является одним из прогрессивных и актуальных средств раннего диагностирования. В переводе с английского обозначает тест на внутриклеточную флуоресцентную гибридизацию. При помощи этого ген-теста онкологи анализируют происхождение опухолей. Также анализ указывает на положительное или отрицательное влияние гена, принимающего участие в патогенезе и прогрессировании рака агрессивного типа - HER2.

Постоянное развитие научных изысканий влияет на удешевление FISH-теста и делает его доступным все большему количеству женщин.

Увеличение лимфатических узлов в подмышках может сигнализировать про развитие заболевания.

• увеличение лимфатических узлов в подмышках;
• уплотнения в зоне груди;
• боль при нажатии на сосок;
• ассиметричность молочных желез;
• дискомфорт и боль в одной из грудей;
• выделения из сосков;
• морщинистая кожа на молочной железе;
• втянутый сосок.

Подготовка и сдача анализа

Никакой особой подготовки для прохождения на фиш-тест не требуется. Нельзя только употреблять спиртные напитки, как и перед сдачей любых анализов и употреблять жирную, мясную и тяжелую пищу. Еда должна быть легкой, лучше, если это будут овощные блюда и соки. Fish-тест при раке молочной железы - безвредная и безопасная процедура, которая проходит в два этапа:

• Гистологический. Под местным воздействием наркоза проводится биопсия биоматериала из груди. Полученный материал обрабатывается специальным красящим веществом с флуоресцентными маркерами. По своим химическим качествам эти маркеры связываются исключительно с обозначенными хромосомами и их наборами в клетках. В результате исследований видны наиболее окрашенные маркером хромосомные наборы, что и указывает на степень изменений в геноме по онкологической принадлежности.
• Фиш-анализ. В вену проводят инфузию компонента ДНК - дезоксирибонуклеиновую кислоту, окрашенную специфическими маркерами. Метки-маркеры встраиваются в геномы на клеточном уровне. Исследование проводится в присутствии пациентки, а итоги анализа предоставляются сразу.

Что показывают результаты?

Гистология молочной железы дает возможность установить разновидность опухоли и причины ее появления.

Fish-анализ при раке молочной железы показывает такие итоги:

• Гистологическое исследование. Результаты выставляются по насыщенности маркеров на участках хромосомных наборов. Число 1 и менее означает, что опасности нет. Цифра обозначает пограничное состояние, требующее дополнительных анализов. Числом 3 обозначают развитие онкологического процесса.
• Фиш-реакция при раке молочной железы. Отрицательный результат реакции означает, что молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты не принимают участия в патогенезе атипичных клеток. При развитии злокачественного образования ген HER2 не влияет на раковую клетку. При положительной реакции в два раза повышается скорость деления генов, участвующих в патогенезе онкологических молекул.

Подобно тому, как в ходе Саузерн-блоттинга нуклеотидные зонды используют для идентификации фрагментов ДНК, цитогенетики могут применять подобные зонды для анализа хромосомных аберраций. Для этого гибридизируют меченные флюоресцентным красителем зонды с ДНК, содержащейся в фиксированных хромосомах на предметных стеклах.

Эта техника называется Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH ), поскольку , содержащаяся в интерфазном хроматине или в метафазных хромосомах, фиксирована и денатурируется на стекле в одном месте (т.е. in situ), для обработки меченым зондом, гибридизирующимся с хромосомной ДНК. Зонд флюоресцирует при освещении хромосом светом с длиной волны, возбуждающей флюоресцентный краситель. Положение гибридизационного сигнала и, таким образом, позицию сегмента ДНК с гибридизированным зондом определяют микроскопически.

Обычно для FISH-анализа используют зонды - фрагменты ДНК, имеющие уникальное положение в хромосоме. Такие зонды проходят гибридизацию и помечают место в каждой гомологичной хромосоме, соответствующее нормальному положению последовательности зонда. FISH-зонд также может быть сложной смесью ДНК, полученной из всего плеча или даже целой хромосомы. В зависимости от состава зонда, при гибридизации с ним помечается вся хромосома или ее часть.

Такие смеси зондов известны как хромосомные зонды. Наконец, можно объединить 24 различных хромосомных зонда, меченных различными комбинациями флюоресцентных красителей, испускающих свечение разной длины волны, для каждой из 24 хромосом человека. Каждая хромосома помечается зондом с собственной характерной комбинацией длин световой волны. Все 24 хромосомных зонда объединяют и используют для FISH-анализа метафазных хромосом. Эта техника известна как спектральное кариотипирование (SKY).

Поскольку каждый хромосомоспецифичный зонд имеет флюоресценцию с собственной комбинацией длин волн, мутантные хромосомы, состоящие из частей различных хромосом, при SKY-анализе хорошо различаются, а хромосомы, включенные в перестройку, могут быть легко идентифицированы. FISH, использующий единичную непрерывную последовательность нуклеотидов, хромосомоспецифические зонды и SKY-метод с комбинацией зондов для всех хромосом, широко применяют в клинической цитогенетике для обнаружения хромосомных аберраций, таких как делеции, инсерции и транслокализации.