Лабораторная диагностика сифилиса. Реакция иммунофлюоресценции (прямая-риф, и непрямая-рниф) как метод экспресс-диагностики инфекционных заболеваний Показания к проведению
При данном методе используют явление люминесценции.
Сущность явления люминесценции заключается в том, что при поглощении различных видов энергии (световой, электрической и др.) молекулами некоторых веществ их атомы переходят в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения.
В РИФ люминесценция проявляется в виде флуоресценции - это свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу после его окончания.
Многие вещества и живые микроорганизмы обладают собственной флуоресценцией (так называемой первичной), однако интенсивность ее очень мала. Вещества, обладающие интенсивной первичной флуоресценцией и используемые для придания флуоресцирующих свойств нефлуоресцирующим веществам, получили название флуорохромы. Такая наведенная флуоресценция называется вторичной.
Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии чаще всего используют ультрафиолетовую или сине-фиолетовую часть спектра (длина волны 300-460 нм). Для этих целей в лабораториях имеются люминесцентные микроскопы различных моделей - МЛ-1-МЛ-4, «Люмам».
В вирусологической практике применяют два основных метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител (или РИФ).
Флуорохромирование - это обработка препаратов флуорохромом с целью увеличения силы и контрастности свечения их. Наибольший интерес представляет флуорохром акридиновый оранжевый, который вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеиновых кислот. Так, при обработке препаратов этим флуорохромом дезоксирибонуклеиновая кислота ярко флуоресцирует зеленым цветом, а рибонуклеиновая - рубиново-красным.
Метод РИФ заключается в том, что антитела, соединенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело в связи с присутствием в нем флуорохрома обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению.
Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные сыворотки, из которых выделяют антитела и метят их флуорохромом. В качестве флуорохрома наиболее часто используют ФИТЦ-флуоресцеин изотиоционат (зеленое свечение) и РСХ-родамин сульфохлорид (красное свечение). Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом.
Методика приготовления и окрашивания препаратов заключается в следующем:
- готовят на предметных стеклах мазки, отпечатки из органов или на покровных стеклах - инфицированную культуру клеток; можно использовать и гистосрезы;
- препараты подсушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне при комнатной температуре или при минус 15 °С (от 15 мин до 4-16 ч);
- окрашивают по прямому или непрямому методу; ведут учет под люминесцентным микроскопом по интенсивности свечения, оцениваемому в крестах.
Параллельно готовят и окрашивают препараты от здорового животного - контроль.
Различают два основных метода применения флуоресцирующих антител: прямой и непрямой.
Прямой метод (одноступенчатый) . На фиксированный препарат наносят конъюгат (флуоресцирующую сыворотку к предполагаемому вирусу), выдерживают 30 мин при температуре 37 °С во влажной камере. Затем препарат отмывают от несвязанного конъюгата физиологическим раствором (pH 7,2 - 7,5), подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом.
Прямой метод позволяет обнаружить и идентифицировать антиген. Для этого нужно иметь на каждый вирус флуоресцирующую сыворотку.
Непрямой метод (двухступенчатый) . На фиксированный препарат наносят немеченую сыворотку, содержащую антитела к предполагаемому вирусу, выдерживают 30 мин при 37 °С, отмывают несвязанные антитела. На препарат наносят флуоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного - продуцента гомологичных противовирусных антител, выдерживают 30 мин при 37 °С. Затем препарат отмывают от несвязанных меченых антител, подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под люминесцентным микроскопом.
Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя глобулинами животных тех видов, которые служат продуцентами антивирусных антител. Так, если антивирусные антитела получали на кроликах, то используют флуоресцирующую антикроличью сыворотку.
Непрямой метод позволяет не только обнаружить и идентифицировать антиген, но и выявить и определить титр антител. Кроме того, этим методом можно обнаруживать одной меченой сывороткой антигены различных вирусов, так как он основан на использовании антивидовых сывороток. Чаще применяют антикроличьи, антибычьи, антилошадиные сыворотки и сыворотки против глобулинов морской свинки.
Разработаны несколько модификаций непрямого метода. Наибольшего внимания заслуживает метод с использованием комплемента. Метод заключается в том, что на фиксированный препарат наносят инактивированную нефлуоресцирующую специфическую сыворотку и комплемент морской свинки, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, и для выявления комплекса антиген + антитело + комплемент наносят флуоресцирующую антикомплементарную сыворотку, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, подсушивают на воздухе и исследуют под люминесцентным микроскопом.
Достоинства РИФ: высокая специфичность и чувствительность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов. Это экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ. К недостаткам можно отнести субъективизм в оценке интенсивности свечения и, к сожалению, иногда флуоресцирующие сыворотки бывают плохого качества. В настоящее время РИФ широко применяют в диагностике вирусных болезней животных.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .
Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.
Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.
Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген - антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген - антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.
22. Иммуноферментный анализ - лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакции антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.
Классификация:
Конкурентный (в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог)
Неконкурентный (Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела))
Прямой и непрямой
1.сыворотку,содержащую смесь ат, инкубируют с аг, фиксированным на твердом субстрате.
2.ат,не связывающие аг, удаляют многократным промыванием.
3. вносят меченную ферментом антисыворотку к ат, связывавшим аг
4.определят количество фермента-маркера, связавшегося с ат
Непрямой:
Ат-положительная сыворотка
1.специфические ат в иследуемой сыворотке связывают аг, фиксированный на твердом субстрате
2. специфичные ат, меченные ферментом,не взаимодействуют со связанным аг-содержание маркера в субстрате низкое
Ат-отрицательная сыворотка
1. Неспецифические ат в исследуемой сыворотке не связывают аг, фиксированный на твердом субстрате
2. Специфические ат, меченные ферментом, взаимодействуют, с фиксированным аг –содержание маркера высокое
Наиболее распространен твердофазный ифа, при котором один из компонентов иммунной реакции(антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе. В качестве твердого носителя используется микропанели из полистирола. При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови, меченную ферментом, и смесь растворов для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена.
Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем-смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.
Применение: для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями.
23. Серологическая реакция - реакция, с помощью которой исследуется реакция антигена (микроба, вируса, чужеродного белка) с антителами сыворотки крови.
Серологические исследования - это методы изучения определенных антител или антигенов в сыворотке крови больных, основанные на реакциях иммунитета. С их помощью также выявляют антигены микробов или тканей с целью их идентификации.
Обнаружение в сыворотке крови больного антител к возбудителю инфекции или соответствующего антигена позволяет установить причину заболевания.
Серологические исследования применяют также для определения антигенов групп крови, тканевых антигенов и уровня гуморального звена иммунитета.
Серологические исследования включают в себя различные серологические реакции:
1. Реакция агглютинации.
2. Реакция преципитации.
3. Реакция нейтрализации.
4. Реакция с участием комплемента.
5. Реакция с использованием меченых антител или антигенов.
Впервые предложена Coombs в 1942 г. РИФ основана на выявлении антигенов в клиническом материале, препаратах клеток крови и др. с помощью моноклональных антител или сывороток, меченных флуорохромом (прямая РИФ). Первые (диагностические) антитела можно выявлять антииммуноглобулиновой сывороткой, меченной флуорохромами (непрямая РИФ). Существуют модификации РИФ для выявления антител к инфекционным агентам в сыворотке крови или антител в сыворотке крови.
Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Сегодня в этой реакции используются как поликлональные сыворотки, так и моноклональные антитела, меченные флюоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ). Для уменьшения неспецифического свечения фона применяют обработку препаратов бычьим сывороточным альбумином, меченным родамином или синькой Эванса.
Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют метиловым спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором. На поверхность фиксированного мазка наносят меченные ФИТЦ сыворотки или моноклональые антитела (в случае непрямой РИФ препарат сначала обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем мечеными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.
Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длинной волны. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.
При постановке РИФ для обнаружения антител готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабатывают меченой сывороткой против иммуноглобулинов человека. В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение эталонной культуры.
Основным недостатком РИФ является ее субъективность.
Классическими критериями специфичности этой реакции являются:
· характерная морфология, размеры и расположение возбудителя в мазке;
· периферический характер свечения объекта;
· цвет флюоресценции;
· интенсивность флюоресценции.
При исследовании крупных объектов (трихомонады, клетки человека, клетки пораженные бактериями или вирусами) эти критерии позволяют получить достоверный результат. В то же время, элементарные тельца хламидий и микоплазмы имеют размеры, лежащие на пределе разрешающей способности люминесцентного микроскопа. При этом оценка морфологии микроорганизмов затруднена, а свечение теряет периферический характер. Остающихся критериев явно недостаточно для уверенной идентификации наблюдаемого микроорганизма. В связи с вышесказанным, субъективный характер учета реакции предъявляет особые требования к квалификации персонала, проводящего исследования.
2.2. Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением (ФИА ВР, Etkins R. et Wallac O., 1984)
Эта разновидность ФИА основана на принципах сорбции одного из реагентов на твердой фазе и применении технологии «сэндвича», т.е. двойного распознавания, подобно тИФА. Однако важным отличием метода является применение в качестве метки хелатов лантаноидов (редкоземельных элементов европия, самария, тербия и диспрозия). Преимущества ФИА ВР – это высокая чувствительность, технология постановки, подобная ИФА, и потенциальная возможность значительного усиления полезного сигнала вследствие весьма высокого отношения сигнал/шум. Специфическая флуоресцентная метка флуоресцирует неизмеримо сильнее и дольше, чем фоновая флуоресценция. Кроме того, метка обладает способностью восстанавливать способность к свечению (для учета применяют импульсное возбуждающее излучение с периодом в 1с - более 1000 импульсов), что приводит к накоплению (усилению) полезного сигнала. Описываемая система реализована фирмой PerkinElmer, США, под названием Delfia и обладает чувствительностью более 10 -17 М при определении антигенов.
2.3. Проточная цитофлуориметрия
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — серологическая реакция, позволяющая выявить антитела к известным антигенам. Метод заключается в микроскопии окрашенных мазков.
Данную реакцию используют в иммунологии, вирусологии и микробиологии. Она позволяет определить наличие вирусов, бактерий, грибов, простейших и ИКК. РИФ очень широко применяется в диагностической практике для обнаружения вирусных и бактериальных антигенов в инфекционном материале. Метод основан на способности флюорохрома вступать в связь с белками, не нарушая при этом их иммунологической специфичности. В основном применяется при диагностике инфекций мочеполовых путей.
Различают следующие методы проведения реакции иммунофлюоресценции: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод заключается в окрашивании материала флюорохромами. Благодаря способности антигенов микробов или тканей светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа, они определяются как клетки с ярко окрашенной каймой зеленного цвета.
Непрямой метод заключается в определении комплекса антиген+антитело. Для этого опытный материал обрабатывается антителами антимикробной кроличьей сыворотки, предназначенной для диагностики. После того как антитела свяжутся с микробами, их отделяют от не связавшихся и обрабатывают антикроличьей сывороткой, помеченной флюорохромом. После этого комплекс микроб+анимикробные антитела+анитикроличьи антитела определяется с помощью ультрафиолетового микроскопа также, как и при прямом методе.
Реакция иммунофлюоресценции незаменима при диагностике сифилиса. Под воздействием флюорохрома возбудитель сифилиса определяется как клетка с желто-зеленой каймой. Отсутствие свечения означает, что пациент не заражен сифилисом. Этот анализ часто назначается при положительной реакции Вассермана. Данный метод очень эффективен при диагностике, так как позволяет определить возбудителя на ранних стадиях заболевания.
Кроме того, что РИФ позволяет диагностировать сифилис, его также применяют для определения наличия таких возбудителей как хламидии, микоплазма, трихомонады, а также возбудителей гонореи и генитального герпеса.
Для проведения анализа используют мазки или венозную кровь. Процедура взятия мазка совершенно безболезненная и не представляет никакой опасности. К сдаче данного анализа необходимо подготовиться. За двенадцать часов до него не рекомендуется пользоваться средствами гигиены, такими как мало или гели. Также иногда по показаниям врача проводиться провокация. Для этого рекомендуют прием острой пищи или алкоголя или проводится инъекция провоцирующего вещества, например гоновакцина или пирогенал. Помимо этого промежуток между приемом антибактериальных препаратов и сдачей анализа должен быть не менее четырнадцати дней.
При оценке результатов следует учитывать тот факт, что свечение наблюдается не только у живых бактерий, но и у мертвых, особенно это относится к хламидиям. После курса антибиотиков мертвые клетки хламидий также обладают свечением.
При правильной подготовке пациента и соблюдении техники взятия мазка, данный анализ позволяет определить заболевания на ранних стадиях, что очень важно для своевременного лечения. Положительными сторонами данного метода является короткие сроки получения результата, простота выполнения и небольшая стоимость анализа.
К недостаткам можно отнести то, что для проведения анализа необходимо достаточно большое количество исследуемого материала. Кроме того, оценку результатов может проводить только опытный специалист.
Реакция основана на том, что иммунные сыворотки обрабатывают флюорохромами (ФИТЦ), которые соединяются с антителами. Сыворотки при этом не теряют своей иммунной специфичности. При взаимодействии полученной люминесцентной сыворотки с соответствующим антигеном образуется специфический светящийся комплекс, легко видимый в люминесцентном микроскопе.
Различные иммунофлюоресцентные сыворотки могут быть использованы для прямого и непрямого метода иммунофлюоресценции. При прямом методе специфические флюоресцирующие иммунные сыворотки готовят для каждого микроба путем иммунизации кролика убитой культурой возбудителя, затем иммунную сыворотку кролика соединяют с флюорохромом (изоционат или изо-тиоционат флюоресцеина). Метод применяется для экспресс-диагностики с целью обнаружения бактериальных или вирусных антигенов.
Непрямой метод предусматривает использование диагностической иммунной не флюоресцирующей сыворотки (иммунизированного кролика или больного человека) и флюоресцирующей сыворотки, имеющей антитела против видовых глобулинов диагностической сыворотки.
Работа № 3
Иммуноферментный анализ (ифа)
Широкое применение находит твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Он основан на том, что белки прочно адсорбируются на пластинках, например из поливинилхлорида. Один из наиболее распространенных на практике вариантов ИФА основан на использовании меченных ферментом специфических антител той же специфичности. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор с анализируемым антигеном. В процессе инкубации на твердой фазе образуются специфические комплексы антиген-антитело. Затем носитель отмывают от не связавшихся компонентов и добавляют гомологичные антитела, меченные ферментом, которые связываются со свободными валентностями антигена в составе комплексов. После вторичной инкубации и удаления избытка этих меченных ферментом антител определяют ферментативную активность на носителе, величина которой будет пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.
При другом варианте ИФА к иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и удаления не связавшихся компонентов с помощью меченных ферментом антиглобулиновых антител выявляют специфические иммунокомплексы. Данная схема является одной из наиболее распространенных при постановке ИФА.
Специфические Исследуемый материал- Специфические антитела Субстрат
антитела возбудитель с пероксидазой для пероксидазы
Исследуемая АГС, меченая
сыворотка пероксидазой Субстрат для
Специфический пероксидазы
Контроль:
позитивный - иммунная сыворотка, меченная пероксидазой + субстрат - 2 лунки;
негативный - нормальная сыворотка + субстрат - 2 лунки.
