прибор для наблюдения и фотографирования многократно (до 10 6 раз) увеличенного изображения объектов, в котором вместо световых лучей используются пучки , ускоренных до больших энергий (30-100 кэв и более) в условиях глубокого вакуума. Физические основы корпускулярно-лучевых оптических приборов были заложены в 1834 (почти за сто лет до появления Электронный микроскоп) У. Р. , установившим аналогии между световых лучей в оптически неоднородных средах и траекториями частиц в силовых полях. Целесообразность создания Электронный микроскоп стала очевидной после выдвижения в 1924 о , а технические предпосылки были созданы немецким физиком X. Бушем, который исследовал фокусирующие осесимметричных полей и разработал магнитную электронную линзу (1926). В 1928 немецкие учёные М. Кнолль и Э. Руска приступили к созданию первого магнитного просвечивающего Электронный микроскоп (ПЭМ) и спустя три года получили изображение объекта, сформированное пучками . В последующие годы (М. фон Арденне, 1938; В. К. , 1942) были построены первые растровые Электронный микроскоп (РЭМ), работающие по принципу сканирования (развёртывания), т. е. последовательного от точки к точке перемещения тонкого электронного пучка (зонда) по объекту. К середине 1960-х гг. РЭМ достигли высокого технического совершенства, и с этого времени началось их применение в научных исследованиях. ПЭМ обладают самой высокой (PC), превосходя по этому параметру световые микроскопы в несколько тыс. раз. Т. н. предел разрешения, характеризующий прибора отобразить раздельно мелкие максимально близко расположенные детали объекта, у ПЭМ составляет 2-3 . При благоприятных условиях можно сфотографировать отдельные тяжёлые атомы. При фотографировании периодических структур, таких как атомные решёток кристаллов, удаётся реализовать разрешение менее 1 . Столь высокие разрешения достигаются благодаря чрезвычайно малой длине (см. ). Оптимальным диафрагмированием [см. в электронной (и ионной) оптике] удаётся снизить (влияющую на PC Электронный микроскоп) при достаточно малой дифракционной ошибке. Эффективных методов коррекции в Электронный микроскоп (см. ) не найдено. Поэтому в ПЭМ магнитные (ЭЛ), обладающие меньшими , полностью вытеснили электростатические ЭЛ. Выпускаются ПЭМ различного назначения. Их молено разделить на 3 группы: Электронный микроскоп высокого разрешения, упрощённые ПЭМ и Электронный микроскоп с повышенным ускоряющим .

ПЭМ с высокой разрешающей способностью (2-3 Å ) - как , приборы многоцелевого назначения. С помощью дополнительных устройств и приставок в них можно наклонять объект в разных на большие углы к оптической оси, нагревать, охлаждать, деформировать его, осуществлять , исследования методами и пр. Ускоряющее электроны достигает 100-125 кв, регулируется ступенеобразно и отличается высокой стабильностью: за 1-3 мин оно изменяется не более чем на 1-2 миллионные доли от исходного . Изображение типичного ПЭМ описываемого типа приведено на рис. 1 . В его оптической системе (колонне) с помощью специальной вакуумной системы создаётся вакуум ( до 10 -6 мм рт. ст.). Схема оптической системы ПЭМ изображена на рис. 2 . Пучок , которых служит накалённый катод, (формируется в и затем дважды фокусируется первым и вторым конденсорами, создающими на объекте электронное «пятно» малых размеров (при регулировке пятна может меняться от 1 до 20 мкм). После сквозь объект часть рассеивается и задерживается диафрагмой. Нерассеянные электроны проходят через отверстие диафрагмы и фокусируются в предметной промежуточной линзы. Здесь формируется первое увеличенное изображение. Последующие линзы создают второе, третье и т. д. изображения. Последняя проекционная линза формирует изображение на флуоресцирующем экране, который светится под воздействием электронов. Увеличение Электронный микроскоп равно увеличений всех линз. Степень и характер рассеяния электронов неодинаковы в различных точках объекта, т. к. толщина, и химический состав объекта меняются от точки к точке. Соответственно изменяется число электронов, задержанных апертурной диафрагмой после прохождения различных точек объекта, а следовательно, и плотность тока на изображении, которая преобразуется в на экране. Под экраном располагается магазин с фотопластинками. При фотографировании экран убирается, и электроны воздействуют на фотоэмульсионный слой. Изображение фокусируется плавным изменением тока, возбуждающего объектива. Токи др. линз регулируют для изменения увеличения Электронный микроскоп

Рис. 3. Сверхвысоковольтный электронный микроскоп (СВЭМ): 1 - бак, в который накачивается электроизоляционный газ (элегаз) до давления 3-5 атм; 2 - электронная пушка; 3 - ускорительная трубка; 4 - конденсаторы высоковольтного источника; 5 - блок конденсорных линз; 6 - объектив; 7, 8, 9- проекционные линзы; 10 - световой микроскоп; 11 - пульт управления.

Растровые Электронный микроскоп (РЭМ) с накаливаемым катодом предназначены для исследования массивных объектов с разрешением от 70 до 200 Å . Ускоряющее в РЭМ можно регулировать в пределах от 1 до 30-50 кв.

Устройство растрового Электронный микроскоп показано на рис. 4 . При помощи 2 или 3 ЭЛ на образца фокусируется узкий электронный зонд. Магнитные отклоняющие развёртывают зонд по заданной площади на объекте. При взаимодействии зонда с объектом возникает несколько видов (рис. 5 ) - вторичные и отражённые электроны; электроны, прошедшие сквозь объект (если он тонкий); рентгеновское и характеристическое ; излучение и т. д.

Рис. 5. Схема регистрации информации об объекте, получаемой в РЭМ. 1 - первичный пучок электронов; 2 - детектор вторичных электронов; 3 - детектор рентгеновского излучения; 4 - детектор отражённых электронов; 5 - детектор светового излучения; 6 - детектор прошедших электронов; 7 - прибор для измерения наведённого на объекте электрического потенциала; 8 - прибор для измерения тока прошедших через объект электронов; 9 - прибор для измерения тока поглощенных в объекте электронов.

Любое из этих излучений может регистрироваться соответствующим коллектором, содержащим датчик, преобразующий в электрические , которые после усиления подаются на (ЭЛТ) и модулируют её пучок. Развёртка пучка ЭЛТ производится с развёрткой электронного зонда в РЭМ, и на экране ЭЛТ наблюдается увеличенное изображение объекта. Увеличение равно отношению высоты кадра на экране ЭЛТ к ширине сканируемой объекта. Фотографируют изображение непосредственно с экрана ЭЛТ. Основным достоинством РЭМ является высокая информативность прибора, обусловленная возможностью наблюдать изображение, используя различных датчиков. С помощью РЭМ можно исследовать , химического состава по объекту, р-n-переходы, производить и многое другое. Образец обычно исследуется без предварительной подготовки. РЭМ находит применение и в технологических процессах ( дефектов микросхем и пр.). Высокая для РЭМ PC реализуется при формировании изображения с использованием вторичных . Она определяется диаметром зоны, из которой эти электроны эмиттируются. Размер зоны в свою очередь зависит от диаметра зонда, свойств объекта, электронов первичного пучка и т. д. При большой глубине проникновения первичных электронов вторичные процессы, развивающиеся во всех направлениях, увеличивают диаметр зоны и PC падает. Детектор вторичных электронов состоит из (ФЭУ) и электронно-фотонного преобразователя, основным элементом которого является с двумя - вытягивающим в виде сетки, находящейся под положительным потенциалом (до нескольких сотен в), и ускоряющим; последний сообщает захваченным вторичным электронам энергию, необходимую для . К ускоряющему электроду приложено около 10 кв; обычно он представляет собой алюминиевое покрытие на сцинтиллятора. Число вспышек сцинтиллятора пропорционально числу вторичных , выбитых в данной точке объекта. После усиления в ФЭУ и в сигнал модулирует пучок ЭЛТ. Величина сигнала зависит от образца, наличия локальных электрических и магнитных микрополей, величины , который в свою очередь зависит от химического состава образца в данной точке. Отражённые электроны регистрируются полупроводниковым (кремниевым) . Контраст изображения обусловлен зависимостью от угла падения первичного пучка и атомного номера . Разрешение изображения, получаемого «в отражённых электронах», ниже, чем получаемого с помощью вторичных (иногда на порядок ). Из-за прямолинейности полёта электронов к коллектору информация об отдельных участках, от которых нет прямого пути к коллектору, теряется (возникают тени). Характеристическое выделяется или рентгеновским кристаллическим или энергодисперсным датчиком - полупроводниковым детектором (обычно из чистого кремния, легированного литием). В первом случае рентгеновские кванты после отражения кристаллом спектрометра регистрируются газовым , а во втором - сигнал, снимаемый с полупроводникового , усиливается малошумящим (который для снижения шума охлаждается жидким азотом) и последующей системой усиления. Сигнал от кристаллического модулирует пучок ЭЛТ, и на экране возникает картина того или иного химического элемента по объекта. На РЭМ производят также локальный рентгеновский . Энергодисперсный детектор регистрирует все элементы от Na до U при высокой чувствительности. Кристаллический спектрометр с помощью набора кристаллов с различными межплоскостными (см. ) перекрывает от Be до U. Существенный недостаток РЭМ - большая длительность процесса «снятия» информации при исследовании объектов. Сравнительно высокую PC можно получить, используя электронный зонд достаточно малого диаметра. Но при этом уменьшается зонда, вследствие чего резко возрастает влияние , снижающего отношение полезного сигнала к шуму. Чтобы отношение «сигнал/шум» не падало ниже заданного уровня, необходимо замедлить сканирования для накопления в каждой точке объекта достаточно большого числа первичных (и соответствующего вторичных). В результате PC реализуется лишь при малых скоростях развёртки. Иногда один кадр формируется в течение 10-15 мин.

Рис. 6. Принципиальная схема просвечивающего растрового электронного микроскопа (ПРЭМ): 1 - автоэмиссионный катод; 2 -промежуточный анод; 3 - анод; 4 - отклоняющая система для юстировки пучка; 5 - диафрагма «осветителя»; 6, 8 - отклоняющие системы для развертки электронного зонда; 7 - магнитная длиннофокусная линза; 9 - апертурная диафрагма; 10 - магнитный объектив; 11 - объект; 12, 14 - отклоняющие системы; 13 - кольцевой коллектор рассеянных электронов; 15 - коллектор нерассеянных электронов (убирается при работе со спектрометром); 16 - магнитный спектрометр, в котором электронные пучки поворачиваются магнитным полем на 90° ; 17 - отклоняющая система для отбора электронов с различными потерями энергии; 18 - щель спектрометра; 19 - коллектор; ВЭ - поток вторичных электронов hn - рентгеновское излучение.

РЭМ с автоэмиссионной пушкой обладают высокой для РЭМ PC (до 30 Å ). В автоэмиссионной пушке (как и в ) используется катод в форме острия, у вершины которого возникает сильное , вырывающее электроны из катода (см. ). Электронная яркость пушки с автоэмиссионным катодом в 10 3 -10 4 раз выше, чем пушки с накалённым катодом. Соответственно увеличивается ток электронного зонда. Поэтому в РЭМ с автоэмиссионной пушкой осуществляют быстрые развёртки, а зонда уменьшают для повышения PC. Однако автоэмиссионный катод работает устойчиво лишь при сверхвысоком вакууме (10 -9 -10 -11 мм рт. ст.), и это усложняет конструкцию таких РЭМ и работу на них.

Просвечивающие растровые Электронный микроскоп (ПРЭМ) обладают столь же высокой PC, как и ПЭМ. В этих приборах применяются автоэмиссионные пушки, обеспечивающие достаточно в зонде диаметром до 2-3 Å . На рис. 6 приведено схематическое изображение ПРЭМ. Две уменьшают диаметр зонда. Ниже объекта расположены - центральный и кольцевой. На первый попадают нерассеянные электроны, и после и усиления соответствующих сигналов на экране ЭЛТ появляется т. н. светлопольное изображение. На кольцевом детекторе собираются рассеянные электроны, создающие т. н. темнопольное изображение. В ПРЭМ можно исследовать более толстые объекты, чем в ПЭМ, т. к. возрастание числа неупруго рассеянных с толщиной не влияет на разрешение (после объекта оптика в ПРЭМ отсутствует). С помощью энергии электроны, прошедшие сквозь объект, разделяются на упруго и неупруго рассеянные пучки. Каждый пучок попадает на свой детектор, и на ЭЛТ наблюдается соответствующее изображение, содержащее дополнительную информацию о рассеивающих объекта. Высокое разрешение в ПРЭМ достигается при медленных развёртках, т. к. в зонде диаметром всего 2-3 Å ток получается слишком малым.

Электронный микроскоп смешанного типа. Сочетание в одном приборепринципов формирования изображения с неподвижным пучком (как в ПЭМ) и сканирования тонкого зонда по объекту позволило реализовать в таком Электронный микроскоп преимущества ПЭМ, РЭМ и ПРЭМ. В настоящее время во всех ПЭМ предусмотрена возможность наблюдения объектов в растровом режиме (с помощью конденсорных линз и , создающих уменьшенное изображение , которое сканируется по объекту отклоняющими системами). Кроме изображения, сформированного неподвижным пучком, получают растровые изображения на экранах ЭЛТ с использованием прошедших и вторичных электронов, характеристические и т. д. Оптическая система такого ПЭМ, расположенная после объекта, даёт возможность работать в режимах, неосуществимых в других приборах. Например, можно одновременно наблюдать на экране ЭЛТ и изображение того же объекта на экране прибора.

Эмиссионные Э. м. создают изображение объекта в электронах, которые эмиттирует сам объект при нагревании, первичным пучком , и при наложении сильного электрического поля, вырывающего электроны из объекта. Эти приборы обычно имеют узкое целевое назначение.

Зеркальные Электронный микроскоп служат главным образом для визуализации электростатического «потенциального рельефа» и магнитных микрополей на объекта. Основным оптическим элементом прибора является , причём одним из служит сам объект, который находится под небольшим отрицательным потенциалом относительно катода пушки. Электронный пучок направляется в зеркало и отражается полем в непосредственной близости от объекта. Зеркало формирует на экране изображение «в отражённых пучках». Микрополя возле поверхности объекта перераспределяют электроны отражённых пучков, создавая на изображении, визуализирующий эти микрополя.

Перспективы развития Электронный микроскоп Повышение PC в изображениях непериодических объектов до 1 Å и более позволит регистрировать не только тяжёлые, но и лёгкие атомы и визуализировать на атомарном уровне. Для создания Электронный микроскоп с подобным разрешением повышают ускоряющее . Сер. физическая», т. 34, 1970; Хокс П., и , пер. с англ., М., 1974; Деркач В. П., Кияшко Г. Ф., Кухарчук М. С., Электронозондовые устройства, К., 1974; Стоянова И. Г., Анаскин И. Ф., Физические основы методов просвечивающей электронной микроскопии, М., 1972; Oatley С. W., The scanning electron microscope, Camb., 1972; Grivet P., Electron optics, 2 ed., Oxf., 1972.

История создания электронного микроскопа

В 1931 году Р. Руденберг получил патент на просвечивающий электронный микроскоп , а в 1932 году М. Кнолль и Э. Руска построили первый прототип современного прибора. Эта работа Э. Руски в 1986 году была отмечена Нобелевской премией по физике, которую присудили ему и изобретателям сканирующего зондового микроскопа Герду Карлу Биннигу и Генриху Рореру . Использование просвечивающего электронного микроскопа для научных исследований было начато в конце 1930-х годов и тогда же появился первый коммерческий прибор, построенный фирмой Siemens .

В конце 1930-х - начале 1940-х годов появились первые растровые электронные микроскопы, формирующие изображение объекта при последовательном перемещении электронного зонда малого сечения по объекту. Массовое применение этих приборов в научных исследованиях началось в 1960-х годах, когда они достигли значительного технического совершенства.

Значительным скачком (в 70-х гг) в развитии было использование вместо термоэмиссионных катодов - катодов Шоттки и катодов с холодной автоэмиссией, однако их применение требует значительно большего вакуума.

В конце 90х - начале 2000х компьютеризация и использование CCD-детекторов значительным образом увеличили стабильность и (относительно) простоту использования.

В последнее десятилетие в современных передовых просвечивающих электронных микроскопах используются корректоры сферических и хроматических аберраций (что вносят основное искажение в получаемое изображение), однако их применение порой значительно усложняет использование прибора.

Виды электронных микроскопов

Просвечивающая электронная микроскопия

Шаблон:Заготовка роздела

Первоначальная вид электронного микроскопа. В просвечивающем электронном микроскопе используется высокоэнергетический электронный пучок для формирования изображения. Электронный пучок создается посредством катода (вольфрамового, LaB 6 , Шоттки или холодной полевой эмиссии). Полученный электронный пучок ускоряется обычно до +200 кэВ (используются различные напряжения от 20кэВ до 1мэВ), фокусируется системой электростатических линз, проходит через образец так, что часть его проходит рассеиваясь на образце, а часть - нет. Таким образом, прошедший через образец электронный пучок несет информацию о структуре образца. Далее пучок проходит через систему увеличивающих линз и формирует изображение на люминесцентном экране (как правило, из сульфида цинка), фото-пластинке или CCD-камере.

Разрешение ПЭМ лимитируется в основном сферической аберрацией . Некоторые современные ПЭМ имеют корректоры сферической аберрации.

Основными недостатками ПЭМ являются необходимость в очень тонком образце (порядка 100нм) и неустойчивость(разложение) образцов под пучком.ааааа

Просвечивающая растровая(сканирующая) электронная микроскопия (ПРЭМ)

Основная статья: Просвечивающий растровый электронный микроскоп

Один из типов просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), однако есть приборы работающие исключительно в режиме ПРЭМ. Пучок электронов пропускается через относительно тонкий образец, но, в отличие от обычной просвечивающей электронной микроскопии, электронный пучок фокусируется в точку, которая перемещается по образцу по растру.

Растровая (сканирующая) электронная микроскопия

В основе лежит телевизионный принцип развертки тонкого пучка электронов по поверхности образца.

Низковольтная электронная микроскопия

Сферы применения электронных микроскопов

Полупроводники и хранение данных Редактирование схем Метрология 3D Анализ дефектов Анализ неисправностей Биология и биологические науки Криобиология Локализация белков Электронная томография Клеточная томография Крио-электронная микроскопия Токсикология Биологическое производство и мониторинг загрузки вирусов Анализ частиц Фармацевтический контроль качества 3D изображения тканей Вирусология Стеклование

Научные исследования Квалификация материалов Подготовка материалов и образцов Создание нанопрототипов Нанометрология Тестирование и снятие характеристик устройств Исследования микроструктуры металлов Промышленность Создание изображений высокого разрешения Снятие микрохарактеристик 2D и 3D Макрообразцы для нанометрической метрологии Обнаружение и снятие параметров частиц Конструирование прямого пучка Эксперименты с динамическими материалами Подготовка образцов Судебная экспертиза Добыча и анализ полезных ископаемых Химия/Нефтехимия

Основные мировые производители электронных микроскопов

См. также

Примечания

Ссылки

• 15 лучших изображений 2011 года, сделанных электронными микроскопами Изображения на рекомендованном сайте являются произвольно раскрашенными, и имеют скорее художественную, чем научную ценность (электронные микроскопы выдают черно-белые а не цветные изображения).

Wikimedia Foundation . 2010 .

Электронная микроскопия - это метод исследования структур, находящихся вне пределов видимости светового микроскопа и имеющих размеры менее одного микрона (от 1 мк до 1-5 Å).

Действие электронного микроскопа (рис.) основано на использовании направленного потока , который выполняет роль светового луча в световом микроскопе, а роль линз играют магниты (магнитные линзы).

Вследствие того, что различные участки исследуемого объекта по-разному задерживают электроны, на экране электронного микроскопа получается черно-белое изображение изучаемого объекта, увеличенное в десятки и сотни тысяч раз. В биологии и медицине в основном используются электронные микроскопы просвечивающего типа.

Электронная микроскопия возникла в 30-х годах, когда были получены первые изображения некоторых вирусов (вируса табачной мозаики и бактериофагов). В настоящее время электронная микроскопия нашла наиболее широкое применение в , и вирусологии, обусловив создание новых отраслей науки. При электронной микроскопии биологических объектов применяют специальные методы приготовления препаратов. Это необходимо для выявления отдельных компонентов изучаемых объектов (клетки, бактерии, вируса и т. д.), а также для сохранения их структуры в условиях высокого вакуума под пучком электронов. При помощи электронной микроскопии изучается внешняя форма объекта, молекулярная организация его поверхности, с помощью метода ультратонких срезов исследуется внутреннее строение объекта.

Электронная микроскопия в сочетании с биохимическими, цитохимическими методами исследования, иммунофлюоресценцией, а также рентгеноструктурным анализом позволяют судить о составе и функции структурных элементов клеток и вирусов.

Электронный микроскоп 70-х годов прошлого века

Электронная микроскопия - изучение микроскопических объектов при помощи электронного микроскопа.

Электронный микроскоп представляет электронно-оптический инструмент, обладающий разрешающей способностью в несколько ангстрем и позволяющий визуально изучать тонкое строение микроскопических структур и даже некоторых молекул.

В качестве источника электронов для создания электронного пучка, заменяющего световой пучок, служит трехэлектродная пушка, состоящая из катода, управляющего электрода и анода (рис. 1).

Рис. 1. Трехэлектродная пушка: 1 - катод; 2 - управляющий электрод; 3 - пучок электронов; 4 - анод.

Электромагнитные линзы, применяемые в электронном микроскопе вместо оптических, представляют многослойные соленоиды, заключенные в панцири из магнитно-мягкого материала, имеющие на внутренней стороне немагнитный зазор (рис. 2).

Рис. 2. Электромагнитная линза: 1 - полюсной наконечник; 2 - латунное кольцо; 3 - обмотка; 4 - панцирь.

Электрические и магнитные поля, создаваемые в электронном микроскопе, являются аксиально симметричными. Благодаря действию этих полей заряженные частицы (электроны), выходящие из одной точки объекта в пределах небольшого угла, вновь собираются в плоскости изображения. Вся электронно-оптическая система заключена в колонне электронного микроскопа (рис. 3).

Рис. 3. Электронно-оптическая система: 1 - управляющий электрод; 2 - диафрагма первого конденсатора; 3 - диафрагма второго конденсатора; 4 - стигматор второго конденсатора; 5 - объект; 6 - линза объектива; 7 - стигматор линзы объектива; 8 - стигматор промежуточной линзы; 9 - диафрагма проекционной линзы; 10 - катод; 11 - анод; 12 - первый конденсатор; 13 - второй конденсатор; 14 - корректор фокусировки; 15 - столик объектодержателя; 16 - диафрагма линзы объектива; 17 - селекторная диафрагма; 18 - промежуточная линза; 19 - проекционная линза; 20 - экран.

Созданный электронной пушкой пучок электронов направляется в поле действия конденсорных линз, которые позволяют в широких пределах изменять плотность, диаметр и апертуру пучка, падающего на исследуемый объект. В камере объекта установлен столик, конструкция которого обеспечивает перемещение объекта во взаимно перпендикулярных направлениях. При этом можно последовательно осмотреть площадь, равную 4 мм 2 , и выбрать наиболее интересные участки.

За камерой объекта расположена линза объектива, которая позволяет достигать резкого изображения объекта. Она же дает первое увеличенное изображение объекта, и с помощью последующих, промежуточной и проекционной, линз общее увеличение можно довести до максимального. Изображение объекта возникает на экране, люминесцирующем под действием электронов. За экраном расположены фотопластины. Стабильность действия электронной пушки, а также четкость изображения наряду с другими факторами (постоянство высокого напряжения и др.) во многом зависят от глубины разрежения в колонне электронного микроскопа, поэтому качество работы прибора в значительной степени определяется вакуумной системой (насосы, каналы откачки, краны, клапаны, уплотнения) (рис. 4). Необходимое разрежение внутри колонны достигается благодаря высокой эффективности вакуумных насосов.

Предварительное разрежение во всей вакуумной системе создает механический форвакуумный насос, затем вступает в действие масляный диффузионный насос; оба насоса включены последовательно и обеспечивают в колонне микроскопа высокое разрежение. Введение в систему электронного микроскопа масляного бустерного насоса позволило на длительное время отключать форвакуумный насос.

Рис. 4. Вакуумная схема электронного микроскопа: 1 - ловушка, охлаждаемая жидким азотом (хладопровод); 2 - высоковакуумный кран; 3 - диффузионный насос; 4 - обходной клапан; 5 - малый буферный баллон; 6 - бустерный насос; 7 - механический форвакуумный насос предварительного разрежения; 8 - четырехходовой клапанный кран; 9 - большой буферный баллон; 10 - колонна электронного микроскопа; 11 - клапан напуска воздуха в колонну микроскопа.

Электрическая схема микроскопа состоит из источников высокого напряжения, накала катода, питания электромагнитных линз, а также системы, обеспечивающей переменным сетевым напряжением электродвигатель форвакуумного насоса, печь диффузионного насоса и освещение пульта управления. К питающему устройству предъявляются очень высокие требования: например, для высокоразрешающего электронного микроскопа степень нестабильности высокого напряжения не должна превышать 5·10 -6 за 30 сек.

Интенсивный электронный пучок образуется в результате термоэмиссии. Источником накала катода, который представляет собой V-образную вольфрамовую нить, служит высокочастотный генератор. Генерируемое напряжение с частотой колебаний 100-200 кГц обеспечивает получение монохроматического электронного пучка. Питание линз электронного микроскопа обеспечивается постоянным высокостабилизированным током.

Рис. 5. Электронный микроскоп УЭМВ-100Б для исследования живых микроорганизмов.

Выпускаются приборы (рис. 5) с гарантированной разрешающей способностью 4,5 Å; на отдельных уникальных снимках получено разрешение 1,27 Å, приближающееся к размеру атома. Полезное увеличение при этом равно 200 000.

Электронный микроскоп - прецезионный прибор, который требует особых методов приготовления препаратов. Биологические объекты малоконтрастны, поэтому приходится искусственно усиливать контраст препарата. Имеется несколько способов повышения контрастности препаратов. При оттенении препарата под углом платиной, вольфрамом, углеродом и т. д. становится возможным определять на электронномикроскопических снимках размеры по всем трем осям пространственной системы координат. При позитивном контрастировании препарат соединяется с водорастворимыми солями тяжелых металлов (уранилацетат, моноокись свинца, перманганат калия и др.). При негативном контрастировании препарат окружают тонким слоем аморфного вещества высокой плотности, непроницаемого для электронов (молибденовокислый аммоний, уранилацетат, фосфорно-вольфрамовая кислота и др.).

Электронная микроскопия вирусов (вирусоскопия) обусловила значительный прогресс в изучении ультратонкой, субмолекулярной структуры вирусов (см.). Наряду с физическими, биохимическими и генетическими методами исследования применение электронной микроскопии способствовало также возникновению и развитию молекулярной биологии. Предметом изучения этого нового раздела биологии является субмикроскопическая организация и функционирование клеток человека, животных, растений, бактерий и микоплазм, а также организация риккетсий и вирусов (рис. 6). Вирусы, крупные молекулы белка и нуклеиновых кислот (РНК, ДНК), отдельные фрагменты клеток (например, молекулярное строение оболочки бактериальных клеток) можно исследовать при помощи электронного микроскопа после специальной обработки: оттенения металлом, позитивного или негативного контрастирования уранилацетатом или фосфорно-вольфрамовой кислотой, а также другими соединениями (рис. 7).

Рис. 6. Клетка культуры ткани сердца обезьяны циномольгус, инфицированная вирусом натуральной оспы (X 12 000): 1 - ядро; 2 - митохондрии; 3 - цитоплазма; 4 - вирус.
Рис. 7. Вирус гриппа (негативное контрастирование (Х450 000): 1 - оболочка; 2 - рибонуклеопротеид.

Методом негативного контрастирования на поверхности многих вирусов были обнаружены закономерно расположенные группы белковых молекул - капсомеры (рис. 8).

Рис. 8. Фрагмент поверхности капсида вируса герпеса. Видны отдельные капсомеры (X500 000): 1 - вид сбоку; 2 - вид сверху.
Рис. 9. Ультратонкий срез бактерии Salmonella typhimurium (Х80 000): 1 - ядро; 2 - оболочка; 3 - цитоплазма.

Внутреннее строение бактерий и вирусов, а также других более крупных биологических объектов можно изучать только после рассечения их при помощи ультратома и приготовления тончайших срезов толщиной 100-300 Å. (рис. 9). Благодаря улучшению методов фиксации, заливки и полимеризации биологических объектов, применению алмазных и стеклянных ножей при ультратомировании, а также использованию высококонтрастирующих соединений для окрашивания серийных срезов удалось получить ультратонкие срезы не только крупных, но и самых мелких вирусов человека, животных, растений и бактерий.

Оглавление темы "Электронная микроскопия. Мембрана.":

Электронные микроскопы появились в 1930-х годах и вошли в повсеместное употребление в 1950-х.

На рисунке изображен современный трансмиссионный (просвечивающий) электронный микроскоп , а на рисунке показан путь электронного пучка в этом микроскопе. В трансмиссионном электронном микроскопе электроны, прежде чем сформируется изображение, проходят сквозь образец. Такой электронный микроскоп был сконструирован первым.

Электронный микроскоп перевернут «вверх дном» по сравнению со световым микроскопом. Излучение подается на образец сверху, а изображение формируется внизу. Принцип действия электронного микроскопа в сущности тот же, что и светового микроскопа. Электронный пучок направляется конденсорными линзами на образец, а полученное изображение затем увеличивается с помощью других линз.

В таблице суммированы некоторые сходства и различия между световым и электронным микроскопами . В верхней части колонны электронного микроскопа находится источник электронов - вольфрамовая нить накала, сходная с той, какая имеется в обычной электрической лампочке. На нее подается высокое напряжение (например, 50 000 В), и нить накала излучает поток электронов. Электромагниты фокусируют электронный пучок.

Внутри колонны создается глубокий вакуум. Это необходимо для того, чтобы сократить до минимума рассеивание электронов из-за столкновения их с частицами воздуха. Для изучения в электронном микроскопе можно использовать только очень тонкие срезы или частицы, так как более крупными объектами электронный пучок почти полностью поглощается. Части объекта, отличающиеся относительно более высокой плотностью, поглощают электроны и потому на сформировавшемся изображении кажутся более темными. Для окрашивания образца с целью увеличения контраста используют тяжелые металлы, такие как свинец и уран.

Электроны невидимы для человеческого глаза, поэтому они направляются на флуоресцирующий , который воспроизводит видимое (черно-белое) изображение. Чтобы получить фотоснимок, экран убирают и направляют электроны непосредственно на фотопленку. Полученный в электронном микроскопе фотоснимок называется электронной микрофотографией.

Преимущество электронного микроскопа :
1) высокое разрешение (0,5 нм на практике)

Недостатки электронного микроскопа :
1) подготовленный к исследованию материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме;
2) трудно быть уверенным, что объект воспроизводит живую клетку во всех ее деталях, поскольку фиксация и окрашивание исследуемого материала могут изменить или повредить ее структуру;
3) дорого стоит и сам электронный микроскоп и его обслуживание;
4) подготовка материала для работы с микроскопом отнимает много времени и требует высокой квалификации персонала;
5) исследуемые образцы под действием пучка электронов постепенно разрушаются. Поэтому, если требуется детальное изучение образца, необходимо его фотографировать.

Чтобы понять принцип работы светового микроскопа, необходимо рассмотреть его строение.

Главный прибор биологии является оптической системой, которая состоит из штатива, осветительной и оптической части. В штатив входят башмак; предметный столик с держателем предметного стекла и двумя винтами, перемещающими столик в двух перпендикулярных направлениях; тубус, тубусодержатель; макро- и микровинты, передвигающие тубус в вертикальном направлении.

Для освещения объекта используют естественное рассеянное или искусственное освещение, которое осуществляется посредством стационарно вмонтированного в башмак микроскопа или соединенного через планку осветителя.

В осветительную систему также входят зеркало с плоской и вогнутой поверхностями и конденсор, расположенный под предметным столиком и состоящий из 2 линз, ирисовой диафрагмы и откидывающейся оправы для светофильтров. Оптическая часть включает наборы объективов и окуляров, которые позволяют изучать клетки на разных увеличениях.

Принцип работа светового микроскопа заключается в том, что пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект. Пройдя через него, лучи света попадают в систему линз объектива. Они выстраивают первичное изображение, которое увеличивается при помощи линз окуляра. В целом объектив и окуляр дают обратное мнимое и увеличенное изображение объекта.

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст.

Разрешающая способность - это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно.

Разрешение микроскопа вычисляет по формуле

где л - длина волны света осветителя,

б - угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в него,

n - коэффициент преломления среды.

Чем меньше длина волны луча, тем более мелкие детали мы сможем наблюдать через микроскоп. И чем выше нумерическая апертура объектива (n, тем выше разрешение объектива.

Световой микроскоп может повысить разрешающую способность человеческого глаза примерно в 1000 раз. Это является "полезным" увеличением микроскопа. При использовании видимой части спектра света конченый предел разрешения светового микроскопа составляет 0,2-0,3 мкм.

Однако следует отметить, что световая микроскопия позволяет нам увидеть частицы, меньшие предела разрешения. Это можно осуществить благодаря методу "Темного поля" или "Ультрамикроскопии".

Рис. 1 Световой микроскоп: 1 - штатив; 2 - предметный столик; 3 - насадка; 4 - окуляр; 5 - тубус; 6 - устройство смены объективов; 7 - микрообъектив; 8 - конденсор; 9 - механизм перемещения конденсора; 10 - коллектор; 11 - осветительная система; 12 - механизм фокусировки микроскопа.

Строение электронного микроскопа

Основная часть электронного микроскопа - полый вакуумный цилиндр (воздух откачан, чтобы исключить взаимодействие электронов с его составляющими и оксисления нити катода). Между катодом и анодом подаётся высокое напряжение, для дополнительного ускорения электронов. В конденсорной линзе(которая представляет собой электромагнит, как и все линзы электронного микроскопа) пучок электронов фокусируется и попадает на изучаемый объект. Прошедшие электроны, формируют на объективной линзе увеличенное первичное изображение, которое увеличивает проекционная линза, и проецируется на экран, который покрыт люминесцентным слоем для свечения при попадании на него электронов.

Рис. 2. Электронный микроскоп: 1 - электронная пушка; 2 - анод; 3 - катушка для юстировки пушки; 4 - клапан пушки; 5 - 1-я конденсорная линза; 6 - 2-я конденсорная линза; 7 - катушка для наклона пучка;8 - конденсор 2 диафрагмы; 9 - объективная линза; 10 - блок образца; 11 -дифракционная диафрагма; 12 - дифракционная линза; 13 - промежуточная линза; 14 - 1-я проекционная линза; 15 - 2-я проекционная линза; 16 - бинокуляр (увеличение 12); 17 - вакуумный блок колонны; 18 - камера для 35-миллиметровой катушечной пленки; 19 - экран для фокусировки; 20 - камера для пластинок; 21 - главный экран; 22 - ионный сорбционный насос.